microRNA-183家族在噪聲性耳聾發(fā)生及發(fā)展中的表達及功能研究.pdf

1、噪聲引起的慢性聽力損失與耳蝸內(nèi)的機械損傷和代謝障礙密切相關(guān)。人們?nèi)绻掷m(xù)在有害的噪聲環(huán)境中工作或生活，由于噪聲長時間的過度刺激很可能會導(dǎo)致耳蝸毛細胞壞死或者凋亡，耳蝸毛細胞內(nèi)的氧自由基活動增強和能量代謝障礙被認為是導(dǎo)致內(nèi)耳毛細胞壞死或者凋亡的主要原因。隨著噪聲性聾發(fā)病機制研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)噪聲性耳聾是環(huán)境和基因兩個因素共同影響的。
　　miRNA在生物體發(fā)展過程中的作用已被廣泛的研究，許多高保守性的miRNA在特定的細胞、器

2、官和生物過程（包括疾?。┲械淖饔靡驳玫搅顺浞值恼J識。其中miR-183家族在內(nèi)耳中具有豐量的表達，并在內(nèi)耳發(fā)育中具有重要的調(diào)控作用，而且miR-183家族與聽力損失也有密切的關(guān)系。因此，miR-183家族與聽力損失之間相關(guān)性的研究將成為熱門。進而探索在基因水平上的治療，特別是有關(guān)促使毛細胞再生領(lǐng)域及聽力提高等方面。由此可見，miR-183家族在聽力學(xué)領(lǐng)域有著不可估量的科學(xué)價值，同時也為人類的聽力開辟一條新的光明之路。
　　本課題通

3、過噪聲頻率為中心頻率2000～4000Hz的窄帶噪聲，給聲強度為100dB SPL，每天連續(xù)6小時，持續(xù)噪聲暴露3天來建立小鼠的噪聲性耳聾（noise-induced hearing loss，NIHL）的動物模型，探討噪聲性耳聾對內(nèi)耳毛細胞(hair cell，HC)的破壞程度，及檢測噪聲性耳聾前后耳蝸內(nèi)miR-183家族成員的表達變化，為進一步闡明噪聲性耳聾的發(fā)病機制打下基礎(chǔ)，也為將來治療噪聲性耳聾提供一條新的思路。本文共分為三個部

4、分。
　　第一部分噪聲性耳聾模型的建立
　　目的:建立噪聲性耳聾動物模型，為研究噪聲性耳聾對內(nèi)耳毛細胞的破壞程度，及檢測噪聲性耳聾前后耳蝸內(nèi)miR-183家族成員的表達變化奠定基礎(chǔ)。
　　方法:50只小鼠隨機分為5組（1、7、14、28d組及對照組），每組10只。實驗組給予中心頻率2000～4000Hz的窄帶噪聲，強度為100dB SPL，每天6小時，持續(xù)3天。對照組不接觸噪聲。在噪聲刺激前及噪聲刺激后1、7、14和2

5、8d后測ABR閾值。
　　結(jié)果:以能分辨出Ⅰ或Ⅱ波波型的最低刺激強度來確定ABR閾值，并重復(fù)2次。噪聲暴露后1d、7d、14d、28d組ABR平均閾值分別為62.50±3.80 dB、44.50±4.56dB、40.25±4.13 dB、40.50±3.20 dB。統(tǒng)計分析示，實驗組噪聲刺激前后ABR閾值均有顯著性差異(P＜0.01)。噪聲刺激后，對照組與實驗組每組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，1d與7d、14d、28d組

6、之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，7d與14d、28d組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，14d與28d組間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:此噪聲刺激可以引起小鼠聽力的永久性閾移，證實基本成功地建立了噪聲性聽力損害的動物模型，為噪聲性耳聾發(fā)病機制的研究打下了基礎(chǔ)。
　　第二部分噪聲性耳聾內(nèi)耳毛細胞的研究
　　目的:檢測噪聲性耳聾后內(nèi)耳毛細胞的破壞情況，為判定噪聲通過損傷毛細胞來破壞聽力提供依據(jù)。

7、
　　方法:各組小鼠在麻醉后迅速斷頭處死，取其雙側(cè)聽泡。用0.5％硝酸銀溶液染色，再取其耳蝸基底膜進行鋪片，用純甘油封片，在倒置相差顯微鏡下觀察并攝片，觀察毛細胞破壞情況。
　　結(jié)果:正常對照組小鼠耳蝸第二回基底膜可見三排外毛細胞（紅箭頭）和一排內(nèi)毛細胞（藍箭頭）均排列整齊，同時染色缺失率極小。清晰可見其外纖毛簇呈倒“v”形，內(nèi)纖毛簇呈寬“u”形;1d組內(nèi)毛細胞排列比較整齊，外毛細胞排列稍顯混亂，且大小不一，但總體缺失仍較少

8、;7d組內(nèi)毛細胞依然排列比較整齊，但外毛細胞可見少量缺失;14d組外毛細胞可見有明顯缺失，主要集中在第一、二排;28d組內(nèi)毛細胞排列較整齊，未見有缺失，外毛細胞見大量缺失。
　　結(jié)論:此程度噪聲可以引起內(nèi)耳毛細胞破壞，同時毛細胞的受損可能是小鼠噪聲性耳聾的早期病理性改變，而且這個過程至少可以延續(xù)到28天。破壞主要在外毛細胞，且多集中在第一、二排。
　　第三部分 miR-183家族在噪聲性耳聾中的表達及研究
　　目的:檢

9、測噪聲性耳聾前后耳蝸內(nèi)miR-183家族成員的表達變化，來探討miR-183家族是否參與了強噪聲誘導(dǎo)耳蝸毛細胞破壞的調(diào)控機制。從而為進一步闡明噪聲性耳聾的發(fā)病機制奠定基礎(chǔ)。
　　方法:采用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測miR-183家族成員表達量的變化。采用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。
　　結(jié)果: qRT-PCR檢測顯示，噪聲刺激后1d和7d組三種基因(miR-183/96/182)的表達量較對照組均下降