鹽霉素對膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞的選擇性殺傷作用及其機制研究.pdf

1、研究背景：
　　 膠質(zhì)瘤，特別是高級別膠質(zhì)瘤的治療非常困難，它在中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤中占有超過30％的比例。世界衛(wèi)生組織將膠質(zhì)瘤分為四個等級，其中Ⅲ級和Ⅳ級預(yù)后兇險，被劃為高級別膠質(zhì)瘤(highgrade gliomas，HGG)，而Ⅳ級膠質(zhì)瘤(膠質(zhì)母細(xì)胞瘤GBM)又在全部膠質(zhì)瘤中占一半以上。即使采取手術(shù)加替莫唑胺同步放化療的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，GBM患者中位生存期僅14.6個月，總生存率僅10％。
　　 腫瘤起源于腫瘤起始

2、細(xì)胞(一般被稱為癌干細(xì)胞)的假說近來吸引了大量關(guān)注，它的發(fā)現(xiàn)為血液系統(tǒng)腫瘤和實體瘤的治療提供了新的治療策略。此外，腫瘤起始細(xì)胞對多種傳統(tǒng)化療藥物的不敏感性為這些化療藥物治療作用的局限性提供了新的解釋。膠質(zhì)瘤中的腫瘤干細(xì)胞或者腫瘤起始細(xì)胞被認(rèn)為是決定腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。雖然腫瘤起始細(xì)胞的特異性鑒別方法還有待研究，但目前許多研究項目已經(jīng)開始致力于發(fā)現(xiàn)特異性殺傷腫瘤起始細(xì)胞的新治療策略。
　　 如果患者具有大量的腫瘤起始細(xì)胞而且只

3、需要其中一小部分就可以引起腫瘤的復(fù)發(fā)，那么殺傷這一類細(xì)胞的治療將對防止腫瘤復(fù)發(fā)起到顯著地療效。殺傷95％的腫瘤細(xì)胞會因腫瘤的體積縮小而看起來很有效果，但是可能殘留的少量腫瘤起始細(xì)胞將會導(dǎo)致復(fù)發(fā)。因此，就算腫瘤起始細(xì)胞不再比普通腫瘤細(xì)胞具有更強的對治療的耐受性，它的存在仍將是腫瘤治療的瓶頸。目前，膠質(zhì)瘤治療的失敗往往不是由于初治的無應(yīng)答，而是由于最初緩解后出現(xiàn)的惡化和復(fù)發(fā)，而腫瘤起始細(xì)胞在膠質(zhì)瘤惡化和復(fù)發(fā)中扮演了關(guān)鍵的角色。于是挑戰(zhàn)集中到

4、了一個關(guān)鍵問題上來，即能否發(fā)現(xiàn)特異性針對腫瘤起始細(xì)胞的藥物或治療策略!
　　 鹽霉素是從白色鏈球菌中分離得到的聚醚類抗生素，發(fā)揮促進(jìn)一價陽離子特別是鉀離子跨膜轉(zhuǎn)運的作用，被廣泛用作抗球蟲病的藥物并添加在動物飼料當(dāng)中藉以促進(jìn)營養(yǎng)吸收、提高飼料利用率。近年來研究發(fā)現(xiàn)鹽霉素能夠選擇性抑制對體外乳腺癌起始細(xì)胞并減少荷瘤瘤小鼠乳腺癌的生長和遷移。在本研究中，鹽霉素對人原代膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞的選擇性殺傷作用得到證實。深入研究鹽霉素對膠質(zhì)瘤起始細(xì)

5、胞測選擇性殺傷作用及其相關(guān)機制，可能為突破膠質(zhì)瘤治療的瓶頸帶來新的希望。
　　 材料和方法：
　　 1、運用原代細(xì)胞培養(yǎng)方法結(jié)合條件培養(yǎng)基壓力篩選法培養(yǎng)人膠質(zhì)瘤標(biāo)本，分離培養(yǎng)出干細(xì)胞樣懸浮生長的膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(Glioma-initiating cells，GICs)，運用條件培養(yǎng)基壓力篩選法從GL261中分離培養(yǎng)出干細(xì)胞樣懸浮生長的細(xì)胞亞群(GL261 neurosphere，GL261-NS)。
　　 2、免

6、疫熒光染色測定GICs以及GL261-Ns中干性標(biāo)志物及其分化培養(yǎng)后貼壁細(xì)胞(Adhesive glioma cells，AGCs)以及GL261 adhesive cells(GL261-AC)分化標(biāo)志物的表達(dá)情況。
　　 3、利用單克隆形成實驗檢測并比較GICs和AGCs以及GL261-NS和GL261-AC的自我更新能力。
　　 4、利用移植成瘤實驗檢測并比較GICs和AGCs的成瘤能力。
　　 5、利用C

7、CK-8試劑盒檢測并比較鹽霉素(salinomycin，SAL)對GICs和AGCs的劑量效應(yīng)關(guān)系，計算各自IC50，，并與VCR、ACNU進(jìn)行對比。
　　 6、利用克隆形成實驗檢測SAL對膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞自我更新能力的影響。
　　 7、利用流式細(xì)胞儀檢測SAL、ACNU、VCR作用后細(xì)胞群體內(nèi)CD133陽性細(xì)胞比率的改變。
　　 8、利用移植成瘤實驗檢測SAL預(yù)處理后膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞成瘤能力的改變。
　　

8、9、利用膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞移植瘤模型，分別采用系統(tǒng)給藥和局部給藥的方式進(jìn)行鹽霉素在體藥效實驗。
　　 10、利用CCK-8法繪制鹽霉素時間-劑量依賴曲線。
　　 11、利用AnnxinV-FITC/PI試劑盒，使用流式細(xì)胞儀檢測SAL對膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞GICs以及GL261-NS凋亡和壞死的影響。
　　 12、利用Western-blot檢測SAL處理前后凋亡執(zhí)行蛋白Caspase3的表達(dá)變化。
　　 主要結(jié)果

9、：
　　 1、利用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行原代培養(yǎng)方法可從人原代膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)本中獲得神經(jīng)球樣懸浮生長的干細(xì)胞樣細(xì)胞。
　　 2、GICs表達(dá)干性標(biāo)志物CD133和Nestin；GICs在含血清培養(yǎng)基中貼壁分化，成為分化的膠質(zhì)瘤細(xì)胞AGCs并表達(dá)分化標(biāo)志物GFAP。
　　 3、GICs的自我更新能力較AGCs明顯增強，計數(shù)結(jié)果顯示GICs單細(xì)胞形成克隆的比例(47.8％±5.6％)是AGCs(4.3％±1.6％)的11倍

10、；GICs、AGCs的梯度密度移植成瘤表明，前者最低成瘤細(xì)胞數(shù)量為1×103(70％SCID鼠成瘤)，而后者最低成瘤細(xì)胞數(shù)量為5×10。。
　　 4、ACNU和VCR對AGCs和GICs均有抑制增殖的作用，但同樣藥物濃度下GICs細(xì)胞具有更強的細(xì)胞活力。
　　 5、培養(yǎng)基血清遞減結(jié)合EGF和bEGF的添加，能夠從小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系GL261獲得干細(xì)胞樣神經(jīng)球(GL261-NS)。
　　 6、GL261-NS中干細(xì)胞

11、標(biāo)志物CD133陽性細(xì)胞較多，而分化的膠質(zhì)瘤細(xì)胞標(biāo)志GFAP表達(dá)較少，可見GL261-NS是膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞較為富集的細(xì)胞亞群，該細(xì)胞在含有血清的培養(yǎng)基中能很快貼壁分化(GL261-AC)。
　　 7、SAL對膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞具有選擇性殺傷作用，其對膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞的IC50接近對分化腫瘤細(xì)胞IC50的十分之一；SAL能降低GL261-NS細(xì)胞中CD133陽性細(xì)胞比例；SAL對膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞及分化膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)比傳統(tǒng)化療藥物VC

12、R和ACNU均要高；SAL能降低GICs的自我更新能力且該作用較ACNU及VCR更強。
　　 8、鹽霉素預(yù)處理膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞能降低移植成瘤率；
　　 9、鹽霉素腹腔給藥對GL261-NS細(xì)胞原位移植成瘤動物具有一定的治療作用，可使荷瘤小鼠中位生存時間延長；
　　 10、鹽霉素局部1次給藥治療方案對GICs和GL261-NS細(xì)胞原位移植成瘤動物均無明顯治療效果。
　　 11、鹽霉素作用下GICs和GL261

13、-NS細(xì)胞活力前三天下降較明顯，至第四天時其殺傷效應(yīng)基本穩(wěn)定，延長時間并不能帶來更強的抑制效果。
　　 12、鹽霉素主要通過誘導(dǎo)凋亡來實現(xiàn)對膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞的殺傷作用。
　　 13、鹽霉素作用后GICs和GL261-NS細(xì)胞中凋亡執(zhí)行蛋白Caspase3均較鹽霉素作用前有所上升，提示鹽霉素可能通過非周期依賴的Caspase3蛋白發(fā)揮誘導(dǎo)凋亡作用。
　　 結(jié)論：
　　 1.通過條件培養(yǎng)基壓力篩選方法從人原代膠

14、質(zhì)細(xì)胞標(biāo)本中獲得的神經(jīng)球樣懸浮生長的細(xì)胞亞群具有膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞的基本生物行為特性，是用于篩選膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞特異性殺傷藥物的良好實驗?zāi)Ｐ汀?br>　　 2.鹽霉素在體外藥效學(xué)試驗中表現(xiàn)出對膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞的選擇性殺傷作用，而且它同時具有殺傷分化后膠質(zhì)瘤細(xì)胞的能力。
　　 3.鹽霉素能延長膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞移植成瘤模型小鼠的中位生存期，顯示出一定的治療作用。
　　 4.鹽霉素可能通過Caspase3蛋白誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞凋亡來發(fā)