MPTP致SAMP8小鼠年齡相關(guān)的黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)損傷及可能機(jī)制探討.pdf

1、帕金森?。≒D）是常見的老年神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，臨床以行動(dòng)遲緩等運(yùn)動(dòng)障礙為主要表現(xiàn)，大多伴有情緒低落，甚至憂郁癥狀。少數(shù)病人出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙及癡呆。具有黑質(zhì)進(jìn)行性的多巴胺能神經(jīng)元丟失和紋狀體多巴胺含量顯著降低的病理生化特點(diǎn)。但其確切的發(fā)病機(jī)制仍不清楚。目前對(duì)于PD的研究主要依賴于PD動(dòng)物模型。合適的動(dòng)物模型能幫助進(jìn)一步解釋疾病病因?qū)W機(jī)制，有助于新的神經(jīng)保護(hù)藥物和治療策略的研究發(fā)展，所以動(dòng)物模型的研究進(jìn)展直接決定了帕金森病的研究進(jìn)程。

2、>　　 神經(jīng)毒素1-甲基-4-苯基-1、2、3、6-四氫吡啶（MPTP）誘導(dǎo)的動(dòng)物模型（如猴、C57BL小鼠）在神經(jīng)化學(xué)、行為學(xué)和組織病理學(xué)上的變化非常接近于臨床上PD病人的癥狀，使得MPTP動(dòng)物模型成為PD研究中最常用的經(jīng)典模型。其中MPTP小鼠模型是研究PD神經(jīng)病理和神經(jīng)生化改變的最有用的動(dòng)物模型。
　　 SAMP8小鼠有自然衰老的特征，且生命周期短（平均10-17個(gè)月），約4-6個(gè)月成熟期后迅速衰老；又在增齡過程中出現(xiàn)學(xué)

3、習(xí)記憶障礙及情感障礙為特點(diǎn)。是目前公認(rèn)的研究衰老和衰老相關(guān)性疾病的很好的動(dòng)物模型，多用于阿爾茨海默?。ˋD）的研究。但SAMP8小鼠所具備的這些特點(diǎn)是目前PD模型研究中的任何一種動(dòng)物都不具備的。眾所周知PD發(fā)病與衰老密切相關(guān)，臨床上PD除了運(yùn)動(dòng)癥狀外，也有認(rèn)知功能障礙和情緒改變的非運(yùn)動(dòng)癥狀。因此SAMP8小鼠應(yīng)用于MPTP-PD動(dòng)物模型的研究會(huì)具有獨(dú)特價(jià)值。但研究報(bào)道不同動(dòng)物對(duì)MPTP和它的毒性代謝產(chǎn)物MPP+的敏感性有顯著的種屬差異，

4、非人靈長類和嚙齒類中C57BL小鼠是目前已知的對(duì)MPTP最為敏感的動(dòng)物。
　　 PD發(fā)病機(jī)制的大量研究發(fā)現(xiàn)黑質(zhì)的多巴胺能神經(jīng)元對(duì)氧化和炎癥的損傷作用非常敏感。小膠質(zhì)細(xì)胞激活參與炎癥和氧化損傷，在PD的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。MPTP的PD模型研究也顯示了小膠質(zhì)細(xì)胞激活與黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)的損害相關(guān)，許多PD動(dòng)物模型研究也證實(shí)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活的藥物能減輕黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元的變性。小膠質(zhì)細(xì)胞激活后，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）表達(dá)增加，

5、生成大量的一氧化氮（NO），NO對(duì)神經(jīng)元有明顯的損害作用。抑制iNOS會(huì)起到神經(jīng)保護(hù)作用。iNOS催生的NO除了對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用，還可上調(diào)血紅素加氧酶-1（HO-1）的表達(dá)生成。HO途徑被認(rèn)為是神經(jīng)元暴露于氧化攻擊下的一個(gè)主要防御機(jī)制。多數(shù)研究認(rèn)為HO-1的表達(dá)具有抗氧化損傷細(xì)胞保護(hù)作用。但在同一干預(yù)處理?xiàng)l件下，小膠質(zhì)細(xì)胞激活、iNOS和HO-1是如何表達(dá)變化的，尚未見系統(tǒng)的研究報(bào)道。
　　 衰老是PD最重要的危險(xiǎn)因素之一，

6、與PD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。動(dòng)物模型研究表明，MPTP對(duì)老年動(dòng)物黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)的損傷更嚴(yán)重。那么小膠質(zhì)細(xì)胞、iNOS和HO-1又是如何參與衰老在PD發(fā)病中的作用機(jī)制的呢？
　　 為此，首先證實(shí)MPTP是否能導(dǎo)致SAMP8小鼠黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)損傷，為SAMP8小鼠應(yīng)用于PD的研究奠定理論基礎(chǔ)；同時(shí)用MPTP干預(yù)不同月齡SAMP8小鼠，探討小膠質(zhì)細(xì)胞、iNOS、HO-1和年齡相關(guān)的黑質(zhì)紋狀體損害的關(guān)系，揭示衰老在PD發(fā)病中作用及可能機(jī)制

7、，為PD的發(fā)病機(jī)制研究和治療提供一個(gè)新的思路。
　　 1.MPP+對(duì)原代培養(yǎng)的SAMP8小鼠中腦神經(jīng)元的毒性作用
　　 目的：體外培養(yǎng)細(xì)胞模型是進(jìn)行帕金森病研究的基本手段之一，與體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相比具有方便、快速、穩(wěn)定和經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，因此我們首先在體外研究MPP+對(duì)SAMP8小鼠中腦神經(jīng)元的影響，為進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。
　　 方法：SAMP8新生1天小鼠的中腦原代培養(yǎng)6天，加入100μM濃度的MPP+，再培養(yǎng)6h

8、、9h、12h和24h后分別對(duì)各時(shí)間點(diǎn)的中腦原代培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)元免疫熒光染色或提取蛋白測(cè)定TH水平。
　　 結(jié)論：MPP+對(duì)原代培養(yǎng)的SAMP8小鼠中腦神經(jīng)元具有毒性作用。MPP+導(dǎo)致SAMP8小鼠中腦神經(jīng)元原代混合培養(yǎng)體系的神經(jīng)元數(shù)量下降，同時(shí)TH蛋白表達(dá)降低，提示MPP+可導(dǎo)致中腦DA能神經(jīng)元損傷死亡。
　　 2.MPTP致SAMP8小鼠黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)的急性損害
　　 目的：進(jìn)一步體內(nèi)研究確定MPTP是否可

9、導(dǎo)致SAMP8小鼠黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)的損害，從行為學(xué)、病理形態(tài)學(xué)和神經(jīng)生化學(xué)方面評(píng)價(jià)MPTP對(duì)SAMP8小鼠黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)的影響，為SAMP8小鼠應(yīng)用于PD的研究提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。
　　 方法：3月齡雄性SAMP8小鼠背部皮下注射MPTP20mg/kg/次，連續(xù)注射4次，每次間隔2小時(shí)。對(duì)照組注射生理鹽水代替MPTP。第8天處死小鼠。檢測(cè)小鼠自主活動(dòng)次數(shù)、黑質(zhì)DA能神經(jīng)元數(shù)量和紋狀體DA含量的變化。
　　 結(jié)論：SAMP

10、8小鼠背部皮下注射MPTP（20mg/kg/2h，注射4次），行為學(xué)顯示自主活動(dòng)減少；病理形態(tài)學(xué)上證實(shí)了黑質(zhì)DA能神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，紋狀體DA能神經(jīng)元投射纖維明顯丟失；神經(jīng)生化研究顯示紋狀體DA含量的顯著降低。MPTP可導(dǎo)致SAMP8小鼠黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)損害。
　　 3.MPTP致SAMP8小鼠年齡相關(guān)的黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)損害
　　 目的：選取3月齡（青年）和6月齡（中老年）的SAMP8小鼠，背部皮下注射MPTP，觀察其行為

11、學(xué)及病理形態(tài)學(xué)、神經(jīng)生化學(xué)方面改變的不同，探討衰老在PD發(fā)病中的作用。
　　 方法：3月齡和6月齡SAMP8小鼠背部皮下注射MPTP20mg/kg/次，連續(xù)注射4次，每次間隔2小時(shí)。對(duì)照組注射生理鹽水代替MPTP。觀察自主活動(dòng)變化。并在MPTP后6h、24h、3d和8d處死小鼠用于檢測(cè)DA神經(jīng)元數(shù)量和DA含量的變化。
　　 結(jié)論：MPTP導(dǎo)致SAMP8小鼠DA能神經(jīng)元及投射纖維的變性丟失具有時(shí)間依賴性。MPTP可導(dǎo)致年齡

12、相關(guān)的SAMP8小鼠黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)損傷，老年小鼠損傷更為嚴(yán)重。提示了衰老是PD易感因素，在外界損傷刺激下，衰老個(gè)體更易發(fā)生PD。
　　 4.MPTP致SAMP8小鼠年齡相關(guān)的黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)損害的可能機(jī)制探討
　　 目的：檢測(cè)3、6月齡SAMP8小鼠給予MPTP前后黑質(zhì)紋狀體小膠質(zhì)細(xì)胞、iNOS和HO-1的變化，探討它們與MPTP導(dǎo)致的SAMP8小鼠年齡相關(guān)的黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)損害的關(guān)系，揭示衰老在PD發(fā)病中的可能作用機(jī)制。<

13、br>　　 方法：小鼠的選擇和處理同第3部分，于MPTP后6h、24h、3d和8d處死小鼠。用免疫組織化學(xué)技術(shù)和western-blot方法檢測(cè)TH、小膠質(zhì)細(xì)胞、iNOS和HO-1的表達(dá)。
　　 結(jié)論：在MPTP-SAMP8小鼠的急性模型中，小膠質(zhì)細(xì)胞的病理變化和iNOS的表達(dá)變化主要發(fā)生在紋狀體區(qū)。小膠質(zhì)細(xì)胞激活在MPTP導(dǎo)致的SAMP8小鼠黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)急性損傷中起重要作用。MPTP組6月齡小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞激活較3月齡小鼠更

14、早更顯著可能與其更嚴(yán)重的黑質(zhì)紋狀體多巴胺能系統(tǒng)損傷有關(guān)。iNOS的表達(dá)增高參與了MPTP對(duì)SAMP8小鼠黑質(zhì)紋狀體的損傷，但在年齡相關(guān)性損傷中不起主要作用。在MPTP導(dǎo)致的年齡相關(guān)的SAMP8小鼠黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)急性損傷中，HO-1的高表達(dá)是一過性短暫的，它的神經(jīng)保護(hù)作用有限。
　　 綜上所述，首次在體內(nèi)外證實(shí)了MPTP可導(dǎo)致SAMP8小鼠黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)損傷，產(chǎn)生自主活動(dòng)減少，DA能神經(jīng)元數(shù)量減少和DA水平顯著降低等帕金森病樣改變