百草枯暴露對小鼠黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)的影響.pdf

1、前言：
　　帕金森?。╬arkinson's disease，PD）是發(fā)生在中老年常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要病變在黑質(zhì)紋狀體通路，顯微鏡下可見黑質(zhì)致密部(substantia nigra pars compacta，SNpc)大量多巴胺能(dopaminergic，DA-ergic)神經(jīng)元凋亡，殘留的神經(jīng)元細(xì)胞胞漿中圓形嗜酸性路易小體(Lewy bodies，LBs)形成。環(huán)境毒素在該病發(fā)病過程中起重要作用。1-甲基-4-苯基

2、-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）是公認(rèn)的可致PD的環(huán)境毒素，作用機(jī)制比較明確。百草枯（paraquat，PQ）是農(nóng)村地區(qū)廣泛使用的除草劑之一，化學(xué)結(jié)構(gòu)與MPTP活性產(chǎn)物1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridiniumion，Mpp+)相似，大量研究表明PQ暴露可能是一個導(dǎo)致PD的危險因素。在PQ致PD機(jī)制研究

3、過程中，PQ誘導(dǎo)的動物模型已顯示出其獨特的作用，可在PQ誘導(dǎo)的嚙齒類動物模型SNpc觀察到典型的帕金森樣改變。PQ誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的效果與PQ的濃度、給藥方式、PQ暴露時間相關(guān)，有些小組建立的PQ小鼠模型最初出現(xiàn)行為學(xué)異常、可觀察到SNpc DA-ergic神經(jīng)元明顯減少，而有些小組的研究并未觀察到上述結(jié)果，PQ暴露對小鼠SNpc DA-ergic神經(jīng)元的選擇性損害作用有待進(jìn)一步研究。本研究將PQ腹腔注射于小鼠體內(nèi)，應(yīng)用自主活動測定的方法檢

4、測小鼠的運動功能，應(yīng)用ELISA方法對小鼠血液中PQ進(jìn)行定性分析，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色和實時定量PCR(real time-PCR，RT-PCR)技術(shù)檢測小鼠SNpc酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)蛋白和mRNA表達(dá)的變化情況，驗證PQ對SNpc DA-ergic神經(jīng)元的選擇性損害作用，同時也為法醫(yī)學(xué)鑒定中PQ對中腦毒理作用機(jī)制的闡明提供依據(jù)。
　　材料與方法：
　　8周齡健康C57BL/6雄鼠

5、20只，體重20g～30g，按體重隨機(jī)分為兩組:給藥組12只，對照組8只。給藥組小鼠按10mg/kg劑量腹腔注射PQ，對照組小鼠腹腔注射相應(yīng)量生理鹽水，每周2次，共6周。停藥后第二天，應(yīng)用自主活動測定的方法檢測兩組小鼠的運動功能。之后，將兩組小鼠麻醉后斷頭處死，收集每只小鼠血清，用于ELISA檢測;剝離整個腦組織，分離左右半腦，右半腦用于蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色、免疫組織化學(xué)染色檢測，左半腦中腦用于R

6、T-PCR檢測。應(yīng)用ELISA方法對兩組小鼠血清中PQ進(jìn)行定性分析。應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法檢測兩組小鼠TH蛋白表達(dá)的變化情況，選取每只小鼠SNpc典型部位連續(xù)5張切片，顯微鏡200×下，計數(shù)每張切片中可看到細(xì)胞核的TH陽性細(xì)胞數(shù)，5張切片的陽性細(xì)胞平均數(shù)為該小鼠SNpc的TH陽性細(xì)胞數(shù);顯微鏡630×下拍照，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件檢測每張切片中TH的光密度值，5張切片的TH光密度值的平均值為該小鼠SNpcTH光密

7、度值。應(yīng)用RT-PCR檢測兩組小鼠SNpc TH mRNA表達(dá)的變化情況。測得的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，用PASW Statistics 18進(jìn)行獨立樣本t檢驗分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、在整個6周暴露過程中，同對照組小鼠相比，PQ組小鼠體重未出現(xiàn)明顯變化。
　　2、自主活動測定實驗顯示，同對照組小鼠相比，PQ組小鼠跨格數(shù)減少26％，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，站立次數(shù)減少37％

8、，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3、ELISA結(jié)果顯示，PQ組血清中可檢測到百草枯，同對照組小鼠相比，光密度值差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　4、免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，PQ組小鼠SNpc DA-ergic神經(jīng)元細(xì)胞核固縮、濃染，神經(jīng)纖維走行紊亂，同對照組小鼠相比，DA-ergic神經(jīng)元密度降低，數(shù)量減少13％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　5、免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，同對照組小鼠相比，PQ組小鼠SNpc DA-ergic神經(jīng)元內(nèi)TH蛋白分

9、布不均，表達(dá)量顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　6、RT-PCR結(jié)果顯示，同對照組小鼠相比，PQ組小鼠SNpc DA-ergic神經(jīng)元內(nèi)THmRNA表達(dá)量顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1、PQ暴露可致C57BL/6小鼠出現(xiàn)類帕金森病癥狀，引起SNpc DA-ergic神經(jīng)元數(shù)量減少，TH蛋白及mRNA表達(dá)水平降低。
　　2、依據(jù)本研究中PQ暴露小鼠所觀察到的SNpc DA-ergic神經(jīng)元的改變，