PI3-k-Akt shRNA對大鼠Thy-1腎炎增生病變的影響.pdf

1、第一部分 P13-k/Akt shRNA真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定目的：構(gòu)建并鑒定針對P13-k/Akt基因的特異性短發(fā)卡RNA(shRNA)真核表達載體，探討沉默大鼠腎組織內(nèi)P13-k/Akt)基因?qū)hy-1腎炎(Tny-1N)增生病變的影響。方法：用DNA重組技術(shù)將針對大鼠P13-k/Akt基因不同位點所設計N8對shRNA序列克隆到真核表達質(zhì)粒pGenesil-1中。在酶切分析及序列測定后，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至大鼠GMCs中，Weste

2、m blotting檢測蛋白的相對表達量來篩選最佳沉默效率的shRNA。結(jié)果：限制性酶切及核酸序列分析表明，重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。Western blotting證實，在多種重組質(zhì)粒中，以shPik3c3-2、shAkt1-4具有最佳的沉默效率。結(jié)論：成功構(gòu)建了P13-k/Akt shRNA的真核表達質(zhì)粒，該結(jié)果為進一步體內(nèi)研究沉默P13-k/Akt信號通路基因?qū)hy-1 N病變的抑制作用奠定了實驗基礎。 第二部分沉默PI3-k/

3、Akt信號通路對Thy-1 N增生病變的影響目的：探討用發(fā)夾狀小干涉RNA(shRNA)沉默大鼠腎組織內(nèi)P13-k/Akt基因?qū)hy一1N增生病變的影響。方法：用水流動力學注射法將shPik3c3-2、shAkt1-4導入大鼠Thy-1 N腎組織，以Real-time PCR檢測大鼠腎皮質(zhì)中血小板反應蛋白-1(Thrombospondin-1，Tsp-1)、轉(zhuǎn)化生長因子-beta 1(Transforming growth facto

4、r-β1，TGF-β1)、細胞周期蛋白(cyclin D2)和纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)mRNA豐度，Westem blotting和免疫組化檢測P-Akt、T-Akt、Tsp-1、TGF-β1、cyclin D2和FN蛋白表達水平。此外，實驗還觀察了大鼠腎臟組織病理學及24h尿蛋白的變化。結(jié)果：將shPik3c3-2、shAkt1-4導A.Thy-1 N大鼠腎組織后，發(fā)現(xiàn)大鼠腎皮質(zhì)中P-Akt和T-Akt蛋白表達水平