基于PI3K-AKT通路探討白芍總苷對系膜增生性腎炎的干預(yù)作用.pdf

1、目的：
　　系膜增生性腎小球腎炎（Mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN）為臨床上常見的慢性腎小球腎炎病理類型，病情遷延難治，預(yù)后較差。機體免疫功能紊亂，炎癥浸潤以及系膜細胞過度增殖與本病的發(fā)展密切相關(guān)。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)是細胞中重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，廣泛參與細胞的增殖、分化、凋亡以及炎癥的發(fā)生等多種功能，對MsPGN疾病的發(fā)生發(fā)展具有重要的調(diào)

2、控作用。白芍總苷(Total glucosides ofpaeonia，TGP)是白芍中的一組糖苷類成分，具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎的作用，近年來被廣泛的應(yīng)用于腎臟疾病的研究，對腎臟疾病具有良好的治療作用，但目前對其原發(fā)性腎炎的研究較少，且相關(guān)的靶點及調(diào)控機制尚未明確。
　　本課題使用經(jīng)典的MsPGN模型慢性血清病腎炎，觀察TGP對MsPGN模型大鼠的干預(yù)作用，同時從TGP對炎癥調(diào)控作用以及對PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相關(guān)信號分子影響

3、作用，探討TGP對MsPGN的干預(yù)機制。
　　方法：
　　使用改良性慢性血清病腎炎模型模擬MsPGN病變過程。采用免疫學(xué)方法制備慢性血清病腎炎大鼠模型:牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)預(yù)免疫+BSA正式免疫+脂多糖(LPS)。探討TGP對MsPGN模型大鼠的治療作用及其干預(yù)機制。
　　1、觀察TGP對MsPGN模型大鼠的影響
　　隨機選取8只大鼠作為空白對照組，其余大鼠用免疫法進行

4、造模，模型檢驗成功后隨機分成模型對照組、白芍總苷高劑量組、白芍總苷低劑量組和醋酸潑尼松組。隨后給予藥物，灌胃給藥5周，給藥期間觀察大鼠的一般情況并測定24h尿蛋白排泄量。給藥5周后，取大鼠血清檢測血肌酐(Serum Creatinine，SCr)、尿素氮(Blood ureanitrogen，BUN)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、總膽固醇(Total cholesterol，TC)、白蛋白(Albumin，ALB)、總蛋

5、白(Total protein，TP)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）。同時取大鼠腎臟進行HE染色觀察大鼠腎臟組織的病理變化，免疫熒光觀察腎小球IgG、C3沉積情況，免疫組織化學(xué)法觀察足細胞損傷標(biāo)記蛋白Desmin表達情況。綜合評價TGP對MsPGN模型大鼠的治療作用。
　　2、觀察TGP對MsPGN模型大鼠炎癥調(diào)控的影響。
　　給予藥物干

6、預(yù)5周后，采用磁珠捕獲法用流式細胞儀對大鼠血清中IL-α、IL-2、IL-10、IFN-γ含量進行測定;使用免疫組織化法觀察巨噬細胞標(biāo)記蛋白CD68的表達情況。評價TGP對MsPGN大鼠血清中炎癥因子的影響以及對腎臟中巨噬細胞炎癥浸潤的影響。
　　3、探討TGP對MsPGN模型大鼠腎臟中PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響作用。
　　藥物干預(yù)治療5周后，提取大鼠腎臟總RNA用qRT-PCR檢測大鼠腎臟中AKT、GSK3-β、C

7、yclin D1、IκB、NF-κB的mRNA的表達情況;提取大鼠腎臟總蛋白用Westernblot檢測PI3K、T-AKT、P-AKT、P-GSK3-β、Cyclin D1蛋白表達情況，以及提取大鼠腎臟組織核蛋白檢測NF-κB蛋白表達情況。探討TGP對MsPGN模型大鼠腎臟中PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。
　　結(jié)果:
　　1、TGP對MsPGN模型大鼠的影響
　　結(jié)果顯示，與模型對照組比較，白芍總苷高、低劑量組

8、能改善MsPGN模型大鼠的活動、進食、毛發(fā)光澤等基本情況情況。同時還能夠降低MsPGN模型大鼠的24h尿蛋白排泄量，降低血清中SCr、BUN、TG、TC、MDA含量，升高血清中ALB、TP、SOD含量，抑制疾病引發(fā)的腎臟腫大。腎臟病理結(jié)果顯示白芍總苷高、低劑量組能減少MsPGN模型大鼠腎臟中系膜細胞增殖，修復(fù)腎小管損傷，減少腎間質(zhì)炎性浸潤。免疫熒光結(jié)果顯示白芍總苷高、低劑量組能夠減少MsPGN模型大鼠腎小球中IgG、C3沉積。免疫組化結(jié)

9、果顯示白芍總苷高、低劑量組能減少MsPGN模型大鼠腎臟中足細胞損傷標(biāo)志蛋白Desmin的表達。
　　2、TGP對MsPGN模型大鼠炎癥調(diào)控的影響
　　結(jié)果顯示，與模型對照組比較，白芍總苷高、低劑量組能降低MsPGN模型大鼠血清中IL-α、IL-10、IFN-γ含量，升高IL-2含量;免疫組化結(jié)果顯示白芍總苷高、低劑量組能減少MsPGN模型大鼠腎臟中巨噬細胞標(biāo)記蛋白CD68的表達。
　　3、TGP對MsPGN模型大鼠腎臟

10、中PI3K/AKT信號通路相關(guān)信號分子的影響作用
　　qRT-PCR結(jié)果顯示，與模型對照組比較，白芍總苷高、低劑量組大鼠腎臟CyclinD1、NF-κB的mRNA的表達顯著性降低，IκB的mRNA表達顯著性升高，AKT和GSK3-β的mRNA的表達沒有差異;Western blot檢測結(jié)果顯示，白芍總苷高、低劑量組大鼠腎臟PI3K、P-AKT、P-GSK3-β、Cyclin D1以及NF-κB蛋白表達減少，T-AKT、P-GSK3

11、-α蛋白表達沒有差異。
　　結(jié)論:
　　1、TGP對MsPGN模型大鼠具有良好的治療作用，能夠減少24h尿蛋白的排泄，改善大鼠的腎功能，改善高血脂和低蛋白血癥的狀況。同時，TGP能改善MsPGN模型大鼠腎臟的病理損傷，減少腎小球中IgG和補體C3的沉積，修復(fù)受損的足細胞。
　　2、TGP能夠調(diào)節(jié)MsPGN模型大鼠體內(nèi)的免疫紊亂，調(diào)節(jié)細胞因子的水平，減少巨噬細胞在腎臟中的炎性浸潤。
　　3、TGP能夠影響PI3K/