Caveolin-1對喉鱗癌細胞生長的影響及與EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的相關(guān)性研究.pdf

1、Caveolin-1是caveolae(細胞質(zhì)膜微囊)的功能蛋白，它與細胞內(nèi)外物質(zhì)的轉(zhuǎn)運、細胞的內(nèi)吞以及細胞信號通路調(diào)節(jié)等功能相關(guān)。目前，caveolin-1和腫瘤之間的關(guān)系也逐漸成為一個新的研究熱點。在許多腫瘤中發(fā)現(xiàn)caveolin-1的表達是下調(diào)的，而轉(zhuǎn)染caveolin-1基因能明顯的抑制某些腫瘤的惡性表型。因此，學(xué)多學(xué)者認為caveolin-1可能是一個抑癌基因。但在另一些腫瘤中，特別是前列腺癌，caveolin-1的表達卻與惡

2、性程度是正相關(guān)的；這使caveolin-1在腫瘤中的角色變得異常模糊，它到底是癌基因還是抑癌基因?Caveolin-1在不同組織類型中可能起著不同的作用。 目前針對喉癌的研究很多，但其確切的發(fā)病機制尚不甚清楚。Caveolin-1的表達在喉鱗癌的發(fā)生、發(fā)展中會發(fā)生什么樣的變化；它和喉鱗癌病人的臨床參數(shù)是否存在一定的相關(guān)性：轉(zhuǎn)染caveolin-1基因會對喉鱗癌細胞造成什么樣的影響?有文獻報道，caveolin-1能影響細胞的凋亡

3、，但其機制目前還不明了，其對喉鱗癌細胞的凋亡會有什么樣的影響?這些問題目前在國內(nèi)外尚未有文獻報道。 因此，本課題中我們制備了caveolin-1的真核表達質(zhì)粒，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人喉鱗癌細胞株HEp2，通過體內(nèi)和體外研究觀察它對細胞生長和表型的影響；通過免疫組織化學(xué)研究喉鱗癌中caveolin-1表達的變化及其與臨床參數(shù)的關(guān)系，為喉鱗癌發(fā)生機制研究提供實驗依據(jù)，為臨床喉鱗癌的診斷和治療提供一定的理論基礎(chǔ)。 第一部分 ：caveol

4、in-1真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEp2細胞。 目的: 構(gòu)建caveolin-1真核表達質(zhì)粒，篩選出穩(wěn)定高表達caveolin-1的HEp2細胞。 方法： 用PCR法從pc-3細胞的cDNA中擴增出人全長caveolin-1基因，并連接到真核表達載體pcDNA3.0上；用脂質(zhì)體法把caveolin-1基因?qū)際Ep2細胞中，通過G418篩選得到caveolin-1高表達的細胞克隆，并用細胞免疫熒光、實

5、時熒光定量PCR和westemblot進行鑒定。 小結(jié)： 成功構(gòu)建了caveolin-1真核表達質(zhì)粒，并篩選得到了穩(wěn)定高表達caveolin-1的HEp2細胞株。 第二部分：轉(zhuǎn)染caveolin-1基因?qū)Ep2細胞生物學(xué)行為影響的體內(nèi)外研究。 目的: 觀察穩(wěn)定轉(zhuǎn)染caveolin-1基因?qū)Ep2細胞生物學(xué)行為的影響。 方法： MTT法檢測細胞的生長能力，軟瓊脂克隆形成實驗檢測

6、細胞錨定非依賴性生長能力，流式細胞儀檢測細胞周期分布和凋亡情況，免疫印跡法檢測Bcl-2、p53和p21蛋白表達，裸鼠移植瘤模型檢測細胞在體內(nèi)成瘤能力及生長速度。 小結(jié) ： caveolin-1高表達能夠明顯抑制HEp2細胞在體內(nèi)、外的生長能力，能夠使細胞停滯于G<,1>/G<,0>期，并且促進凋亡，其促凋亡的機制可能與Bc1-2表達的下調(diào)有關(guān)。 第三部分：轉(zhuǎn)染caveolin-1基因?qū)gp2細胞EGFR及下游

7、MAPKs通路的影響。 目的: 觀察轉(zhuǎn)染caveolin-1基因在HEp2細胞中對EGFR及其下游MAPKs信號通路的影響。 方法： 免疫印記法檢測HEp2-CAV1-2、HEp2-CAV1-3組、空載對照組和未轉(zhuǎn)染組細胞的total-EGFR、p-EGFR、total-Erk1/2和p-Erk1/2蛋白水平；免疫組織化學(xué)法檢測裸鼠移植瘤中p-EGFR和p-Erk1/2蛋白水平。細胞免疫雙標法和免疫共沉淀

8、檢測caveolin-1與EGFR的結(jié)合情況。 小結(jié)： 在HEp2細胞中，存在caveolin-1和EGFR的結(jié)合，轉(zhuǎn)染caveolin-1基因能抑制EGFR的磷酸化并下調(diào)其下游MAPKs通路的活性。 第四部分：人喉鱗癌組織中caveolin-1和hTERT的表達和臨床參數(shù)的關(guān)系。 目的: 檢測caveolin-1和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)mRNA在人喉鱗癌組織中的表達變化，并分析其與各臨床

9、參數(shù)之間的關(guān)系。 方法： 收集臨床喉鱗癌新鮮手術(shù)切除組織標本，置液氮中保存；用原位雜交法檢測人喉鱗癌組織中hTERT mRNA的表達，用免疫組織化學(xué)法檢測組織中caveolin-1 的表達；分別統(tǒng)計分析兩者與臨床參數(shù)的相關(guān)性，以及兩者之間的相關(guān)性。 小結(jié)： 喉鱗癌中hTERT mRNA的陽性率明顯高于正常組織和不典型增生，有助于喉部良惡性病變的鑒別；喉鱗癌中caveolin-1的陽性率低于正常組織和不典型

10、增生，無統(tǒng)計學(xué)差異，但有待于進一步擴大樣本量再分析。 結(jié)論： 1、成功構(gòu)建了caveoin-1真核表達質(zhì)粒pcDNA3.0-CAV1，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEp2細胞后篩選得到 3 株高表達caveolin-1 的細胞克隆HEp2-CAV1-1、HEp2-CAV1-2和HEp2-CAV1-3。 2、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染caveolin-1基因能明顯抑制HEp2細胞體內(nèi)外生長和錨定非依賴性生長能力；使HEp2細胞停滯于G<,1>/G<,0

11、>期，并促進凋亡；其促凋亡的機制可能與bc1-2的下調(diào)有關(guān)。 3、在HEp2細胞中，caveolin-1能于EGFR結(jié)合，轉(zhuǎn)染caveolin-1基因能抑制EGFR 的磷酸化，并下調(diào)其下游MAPKs信號通路的活性水平。 4、喉鱗癌中hTERTmRNA的陽性率明顯高于正常組織和不典型增生，有助于喉部良惡性病變的鑒別；喉鱗癌中 caveolin-1 的陽性率低于正常組織和不典型增生，無統(tǒng)計學(xué)差異，但建議有待于擴大樣本量進一步