地衣芽孢桿菌ZJU12所產(chǎn)細(xì)菌素的分離純化及其理化性質(zhì)和基因克隆的研究.pdf

1、地衣芽抱桿菌ZJU12從土壤中分離出來，能產(chǎn)生細(xì)菌素，對(duì)多種革蘭氏陽性細(xì)菌和植物病原真菌有拮抗作用，但是對(duì)除水稻白葉枯病原菌以外的革蘭氏陰性細(xì)菌沒有拮抗作用。地衣芽抱桿菌ZJU12所產(chǎn)細(xì)菌素對(duì)蛋白酶K和胰蛋白酶敏感。經(jīng)100攝氏度30分鐘后仍具有拮抗活性，121攝氏度15分鐘后完全失活。地衣芽抱桿菌ZJU12的去菌液在pH 2--9內(nèi)具有拮抗活性，其中最適pH值在6.5左右。細(xì)菌培養(yǎng)去菌液經(jīng)65％硫酸按沉錠、DEAE-52離子交換色譜、

2、Superdex 75凝膠過濾色譜，并經(jīng)過Triclne-SDS-PAGE和HPLG檢測(cè)純度，純化得到一種分子量在3.5KDa左右的細(xì)菌素。利用LC-MS/NH4S方法得到序列分別為MHENVEEYLPMN, QPATEYLYNTDY, LLPLLUDTY的三段肚鏈。經(jīng)查詢，沒有發(fā)現(xiàn)與己知序列的同源性(NCSI)。純化的抗菌物質(zhì)也進(jìn)行了N端測(cè)序，但沒有得到氨基酸序列。地衣芽抱桿菌ZJU12的拮抗粗提物最高在0.8g/20g的劑量時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)

3、小鼠沒有急性毒性。 通過測(cè)定乳酸鏈球菌素(sin)和地衣芽抱桿菌ZJU12的去菌液((cFSb)對(duì)黃色微球菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽胞桿菌的抑菌作用，發(fā)現(xiàn)黃色微球菌比其他兩種指示菌對(duì)乳酸鏈球菌素和去菌液更加敏感，表現(xiàn)出更低的最小抑菌濃度值。用棋盤稀釋法和殺菌時(shí)間法測(cè)定發(fā)現(xiàn)nisin和cFSb具有協(xié)同作用。從部分抑菌濃度指數(shù)來看，naisin和CFSb的聯(lián)合對(duì)蠟樣芽胞桿菌具有最顯著的協(xié)同抑菌作用。naisin和CFSb在30分鐘內(nèi)

4、就表現(xiàn)出殺菌作用，而它們的協(xié)同殺菌作用在4小時(shí)后才表現(xiàn)出來。 用Superdex 75凝膠過濾色譜的第二峰尖收集液免疫新西蘭大白兔獲得多克隆抗體。用斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法和目標(biāo)抗原的拮抗作用法對(duì)抗原抗體反應(yīng)的敏感性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明發(fā)現(xiàn)拮抗作用法比斑點(diǎn)ELISA具有更好的靈敏性。拮抗作用法只需抗原1OOAU/ml,抗體1: 8000就能檢測(cè)到抗體抗原反應(yīng)，而斑點(diǎn)ELISA需抗原200AU/ml.抗體1:2000。經(jīng)檢測(cè)地衣芽抱