人源化氨基端脂多糖結(jié)合蛋白（NH-LBP）基因工程抗體的構(gòu)建及其生物學(xué)活性研究.pdf

1、內(nèi)毒素血癥是臨床創(chuàng)(燒)傷病人最常見的并發(fā)癥之一。作為基因工程抗體的scFv片段已成為目前研究中最常用的一種抗體形式，它是一種線性的多肽，相對(duì)分子質(zhì)量約為26kDa，是由重鏈的可變區(qū)(VH)和輕鏈的可變區(qū)(VL)通過一個(gè)柔性的肽段(Gly4Ser1)3連接而成的異二聚體，scFv是針對(duì)特異性抗原的具有較高親和力的抗體片段的最小功能分子。與體積較大的抗體片段如Fab'，F(xiàn)ab'2和IgG相比，scFv在非靶組織內(nèi)沉積較少，在血循環(huán)中的清除

2、速度快以及更易滲透入靶組織內(nèi)，由于這些優(yōu)點(diǎn)使得scFv具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。在scFv制備過程中抗體庫的容量大小是決定能否篩選出高親和力抗體的關(guān)鍵因素，而核糖體展示技術(shù)則易于構(gòu)建大容量的文庫(庫容約1012-1013左右)；減少細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)所產(chǎn)生的差異性；更易產(chǎn)生突變，利于篩選出高親和力的抗體等。由于核糖體展示技術(shù)產(chǎn)生的文庫容量不受轉(zhuǎn)染的限制，因此更易于從抗體庫中篩選到抗原特異性scFv。 目的：通過基因工程技術(shù)構(gòu)建人源化sc

3、Fv抗體庫，采用核糖體展示技術(shù)在體外篩選與NH-LBP有較高親合力的scFv抗體及編碼的cDNA，在酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)scFv抗體并初步觀察該抗NH-LBPscFv抗體在體內(nèi)外的生物學(xué)活性。 方法：一、用含有人LBP與LPS結(jié)合活性部位的穿梭質(zhì)粒pBacmidtLBP轉(zhuǎn)染sf21昆蟲細(xì)胞，獲得高滴度的重組病毒液；以此重組病毒液感染對(duì)數(shù)生長期的sf21昆蟲細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，金屬親和樹脂純化含有NH-LBP的培養(yǎng)上清，SDS-PAGE電泳及

4、Western-Blot鑒定純化后產(chǎn)物。 二、分離健康人外周血淋巴細(xì)胞，用RT-PCR技術(shù)分別擴(kuò)增抗體的VH和VL片段，將二者以SOE-PCR方法通過一段柔性肽段(Gly4Ser1)3連接起來構(gòu)成scFv抗體文庫。 三、應(yīng)用PCR的方法使scFv抗體庫帶上T7啟動(dòng)子，AUG啟動(dòng)子、一段Kozak序列。運(yùn)用核糖體展示技術(shù)在體外表達(dá)scFv抗體文庫，表達(dá)產(chǎn)物轉(zhuǎn)膜檢測目的片段，同時(shí)用NH-LBP標(biāo)板篩選表達(dá)產(chǎn)物，篩選后的ARM

5、復(fù)合體進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，共進(jìn)行5輪富集篩選。 四、應(yīng)用基因重組的方法將篩選到的編碼抗NH-LBPscFv抗體的cDNA與pPMETaA相連，轉(zhuǎn)入嗜甲醇畢赤酵母細(xì)胞PMAD11中，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后將細(xì)胞裂解上清純化鑒定。 五、用所得scFv抗體干預(yù)FITC-LPS處理后的U937細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測該抗體阻斷LPS與U937細(xì)胞的結(jié)合能力；同時(shí)用scFv抗體干預(yù)燒傷合并內(nèi)毒血癥小鼠動(dòng)物模型，觀察不同時(shí)相點(diǎn)(1、3、6、1

6、2、24小時(shí))小鼠肝、肺、腎等臟器的形態(tài)學(xué)變化，檢測各組小鼠血漿中炎性細(xì)胞因子TNF-a、IL-6濃度的變化。 結(jié)果：一、經(jīng)過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)sf21昆蟲細(xì)胞的表達(dá)、金屬親和樹脂純化和鑒定后獲得相對(duì)分子質(zhì)量約為30kDa的NH-LBP，總量約2.624mg。 二、從人外周血淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增出抗體的VH(約340bp)和VL片段(325bp)，連接后得到人源化scFv抗體文庫(片段大小約為750bp)；將體外表達(dá)的scFv抗

7、體庫產(chǎn)物轉(zhuǎn)膜后檢測到相對(duì)分子質(zhì)量約為27kDa的目的條帶，經(jīng)過5輪體外表達(dá)、富集篩選后得到編碼可與NH-LBP高度結(jié)合的scFv抗體的cDNA。 三、編碼scFv抗體的cDNA測序后在GeneBank中進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果顯示序列中1-811bp編碼抗體的VH，812-856bp編碼linker，857-1200bp編碼抗體的VL，所得編碼scFv的cDNA序列正確。將核酸序列轉(zhuǎn)化為氨基酸序列后在GeneBank中的Immunog

8、lobinBLAST進(jìn)行比對(duì)，顯示所得cDNA序列翻譯產(chǎn)物含有抗體的VH和VL部分。 四、編碼scFv抗體的cDNA轉(zhuǎn)染酵母細(xì)胞PMAD11，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)72hrs后，細(xì)胞裂解上清經(jīng)SDS-PAGE電泳及Western-Blot鑒定，表達(dá)產(chǎn)物為相對(duì)分子質(zhì)量約35kDa的scFv抗體，總量約5.4062mg。 五、FCM檢測所得scFv抗體干預(yù)FITC-LPS與U937細(xì)胞的結(jié)合能力，結(jié)果顯示：較大量的scFv抗體能夠抑制

9、FITC-LPS與U937細(xì)胞的結(jié)合，吸收峰處于基線水平。 六、scFv抗體干預(yù)燒傷合并內(nèi)毒素血癥小鼠動(dòng)物模型后，與模型組相比觀察發(fā)現(xiàn)肝竇內(nèi)充血減輕、炎性細(xì)胞浸潤不明顯，肝細(xì)胞腫脹也明顯減輕；肺組織的炎性滲出和肺泡間隔的充血水腫減輕、炎細(xì)胞減少；腎組織內(nèi)毛細(xì)血管擴(kuò)張、炎性細(xì)胞浸潤不明顯。 血漿中TNF-α濃度在燒傷合并內(nèi)毒素處理后即顯著增高，3hrs達(dá)到頂峰，隨后逐漸降低，模型組各時(shí)相點(diǎn)與對(duì)照組相比，差異有顯著性(p＜0

10、.01，p＜0.05)。干預(yù)組與相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)的模型組相比，在最初3hrs內(nèi)TNF-α濃度下降，差異有顯著性(p＜0.05)；3hrs以后差異不顯著(p＞0.05)。 血漿中IL-6含量在建模1hr即增高達(dá)到頂峰，3hrs以后的模型組IL-6水平與對(duì)照組相比有顯著差異(p＜0.01,p＜0.05)。scFv干預(yù)后IL-6的含量下降比較明顯，但除干預(yù)后6hrs組和同一時(shí)相點(diǎn)的模型組相比有顯著差異外(p＜0.01)，其余各組差異均無顯著

11、性(p＞0.05)。 結(jié)論：一、運(yùn)用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)、純化獲得了NH-LBP；成功地從人外周血淋巴細(xì)胞中構(gòu)建了人源化的單鏈抗體庫。運(yùn)用核糖體展示技術(shù)對(duì)單鏈抗體庫進(jìn)行體外翻譯、篩選，獲得了可與NH-LBP高度結(jié)合的編碼scFv抗體的cDNA，經(jīng)過序列分析比對(duì)符合scFv的序列特征。 二、應(yīng)用嗜甲醇畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)和金屬螯合層析等方法表達(dá)純化出重組的抗NH-LBP的scFv抗體，相對(duì)分子質(zhì)量約為35kDa。經(jīng)過體內(nèi)外生物

12、學(xué)活性實(shí)驗(yàn)顯示：在細(xì)胞水平，人源化的抗NH-LBPscFv抗體能夠在一定程度上阻斷FITC-LPS與U937細(xì)胞的結(jié)合。在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明燒傷合并內(nèi)毒素血癥小鼠經(jīng)scFv抗體干預(yù)后血漿中炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的含量有所下降，部分內(nèi)臟器官的炎性改變減輕，提示該抗體對(duì)內(nèi)毒素血癥動(dòng)物有一定的保護(hù)作用。 三、本研究率先運(yùn)用人源化基因工程抗體技術(shù)來研究內(nèi)毒素血癥的防治，首次在酵母細(xì)胞中表達(dá)獲得抗NH-LBP的scFv抗體。該研究結(jié)