hBMSCs腦內(nèi)移植的安全評(píng)價(jià)、遷移、分化及遷移機(jī)制初探.pdf

1、背景：中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病是一組嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，主要包括腦血管疾病和神經(jīng)變性疾病，多表現(xiàn)為神經(jīng)元的變性缺失，神經(jīng)系統(tǒng)無(wú)法產(chǎn)生新的神經(jīng)元，建立新的突觸聯(lián)系，致使中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后結(jié)構(gòu)和功能難以恢復(fù)，而目前現(xiàn)有的臨床治療方法有限，不能達(dá)到有效恢復(fù)神經(jīng)功能的目的。因此尋找新的方法對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療至為關(guān)鍵。而干細(xì)胞移植為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病建立了一個(gè)新的技術(shù)平臺(tái)。 MSCs為中胚層來(lái)源的多能干細(xì)胞，主要存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，以

2、骨髓組織中含量最為豐富。來(lái)源于骨髓的MSCs稱為骨髓MSCs( bonemarrow-derived MSCs, BMSCs)，其具有多向分化的潛力，獲取方便，易于分離培養(yǎng)和鑒定，遺傳背景穩(wěn)定，體內(nèi)植入免疫反應(yīng)比較弱等優(yōu)點(diǎn)。自從首次報(bào)道間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)在腦內(nèi)可以向神經(jīng)細(xì)胞分化后，MSCs移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病就成為了非常感興趣的課題。本實(shí)驗(yàn)采用的人BMSCs(human hBMS

3、Cs)來(lái)源于健康志愿者，前期工作已證實(shí)其在體外具有多向分化的潛能、并能快速擴(kuò)增、可誘導(dǎo)免疫耐受、能減輕或抑制移植物抗宿主病等，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病及血液病的臨床前期及臨床研究中頗受重視。目前MSCs的移植途徑主要包括直接腦內(nèi)注射和間接通過靜脈、動(dòng)脈及腹腔注射等。間接途徑移植為全身治療，到達(dá)病變部位的時(shí)間較長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量較少，發(fā)揮作用較慢等，而腦內(nèi)注射移植為局部治療，創(chuàng)傷小，起效快，并且腦內(nèi)的免疫應(yīng)答能力比較弱，因此直接腦內(nèi)注射成

4、為局部治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一個(gè)很好的選擇。己有研究報(bào)道同種異體BMSCs小鼠腦內(nèi)移植沒有發(fā)現(xiàn)明顯副作用，并能在大腦內(nèi)遷移和向神經(jīng)細(xì)胞方向分化。但hBMSCs直接腦內(nèi)移植的安全性如何?其腦內(nèi)移植后能否進(jìn)行遷移?能否分化為神經(jīng)元及其他神經(jīng)細(xì)胞?如果hBMSCs能夠在腦內(nèi)進(jìn)行遷移，其遷移途徑及遷移機(jī)制如何?這些都是hBMSCs臨床應(yīng)用前期pR需解決的問題。方法我們分別利用小動(dòng)物Wistar大鼠和與人類最為接近的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物食蟹猴作為研究對(duì)

5、象，腦內(nèi)直接注射hBMSCs觀察hBMSCs直接腦內(nèi)注射的安全性，通過對(duì)hBMSCs體外標(biāo)記示蹤和攜帶的男性特異基因的檢測(cè)觀察hBMSCs在腦內(nèi)的遷移及遷移途徑，應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)記觀察移植的hBMSCs在腦內(nèi)的分化。Real-timePCR及免疫組織化學(xué)的方法用來(lái)檢測(cè)部分神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、細(xì)胞因子以及薪附分子在hBMSCs移植后的表達(dá)情況。結(jié)果我們的結(jié)果顯示直接腦內(nèi)注射hBMSCs未引起受試動(dòng)物出現(xiàn)全身癥狀，包括精神、飲食、運(yùn)動(dòng)等方面。移植

6、hBMSCs的局部腦組織炎癥反應(yīng)比較局限，未觀察到明顯的免疫反應(yīng)，未觀察到腦組織的變性壞死和明顯膠質(zhì)細(xì)胞聚集。hBMSCs移植4周后，仍大量存活，并可在腦內(nèi)廣泛遷移，且遷移分布具有一定的規(guī)律性，可觀察到不同移植受體細(xì)胞分布重疊現(xiàn)象。hBMSCs遷移分布模式圖顯示不管是在大鼠，還是在食蟹猴，hBMSCs有從前腦向后腦遷移的趨勢(shì)。在大鼠，hBMSCs主要沿拼服體一外囊軸線和室管膜下方向遷移，而且隨著移植時(shí)間的推移，hBMSCs逐漸向?qū)?cè)遷移

7、:在食蟹猴，hBMSCs有向血管和室管膜下遷移的趨勢(shì)。因此我們推測(cè)血液循環(huán)和腦脊液循環(huán)可能是hBMSCs遷移的一個(gè)途徑之一。免疫熒光雙標(biāo)記結(jié)果顯示移植的hBMSCs能表達(dá)神經(jīng)元的標(biāo)記物NeuN和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物GFAP，說明hBMSCs可在腦內(nèi)向神經(jīng)細(xì)胞方向分化。hBMSCs移植后，部分神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和生長(zhǎng)因子和神經(jīng)鈣粘素(N-cadherin)表達(dá)明顯升高。神經(jīng)鈣粘素介導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中神經(jīng)細(xì)胞的遷移，在細(xì)胞的遷移過程中也發(fā)揮重要

8、作用，因此，N-cadherin也可能誘導(dǎo)hBMSCs在腦內(nèi)的遷移。我們應(yīng)用hUCMSCs作為研究對(duì)象，應(yīng)用transwell小室遷移系統(tǒng)檢測(cè)了N-cadherin對(duì)hUCMSCs的體外遷移作用，結(jié)果表明N-cadherin具有明顯趨化hUMSCs遷移的作用，并且發(fā)現(xiàn)其能夠上調(diào)細(xì)胞內(nèi)源性N-cadherin和p連環(huán)蛋白的表達(dá)，因此N-cadherin也可能介導(dǎo)了hBMSCs在腦內(nèi)的遷移。結(jié)論：hBMSCs直接腦內(nèi)注射移植，沒有引起明顯的

9、副作用;hBMSCs可以在腦內(nèi)長(zhǎng)期存活，并能進(jìn)行遷移和分化;hBMSCs移植后上調(diào)腦組織內(nèi)部分細(xì)胞因子和神經(jīng)鈣粘素的表達(dá)，這可能是其在腦內(nèi)遷移的一個(gè)機(jī)制之一。
　　 目的：探討食蟹猴腦缺血模型在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bonemarrow2 derived mesenchymal stem cells, hBMSCs)移植后對(duì)腦缺血損傷的保護(hù)作用和IL-10的表達(dá)情況。方法：食蟹猴8只，在腦定位儀定位下，應(yīng)用光化學(xué)法構(gòu)建

10、食蟹猴腦缺血模型，并將其隨機(jī)分為高劑量治療組、低劑量治療組和模型組，分別在腦缺血部位附近注射高、低密度的hBMSCs和生理鹽水。術(shù)后，通過影像學(xué)、神經(jīng)功能評(píng)分及組織病理學(xué)觀察對(duì)hBMSC的治療效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。并應(yīng)用原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)的方法觀察腦缺血周圍腦組織神經(jīng)細(xì)胞的凋亡情況，免疫組織化學(xué)的方法被用來(lái)觀察腦缺血周圍腦組織神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)和室管膜下細(xì)胞的增殖情況，并應(yīng)用免疫組織化學(xué)、real-time PCR和Western blot檢測(cè)檢側(cè)

11、腦損傷周圍IL,-10的表達(dá)水平。結(jié)果與模型組相比，hBMSCs移植能明顯改善腦缺血模型的癥狀，hBMSC治療能夠減少損傷部位周圍細(xì)胞的凋亡，減輕腦缺血周圍腦組織的膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)，促進(jìn)室管膜下細(xì)胞的增殖。免疫組織化學(xué)顯示IL,-10陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量及染色強(qiáng)度均較模型組明顯升高，real-time PCR和Western Blot也證明1L-10在hBMSCs移植治療后表達(dá)升高。結(jié)論：IBMSCs對(duì)食蟹猴腦缺血模型具有修復(fù)作用，其治療機(jī)制可能