幽門螺桿菌23SrRNA外克拉霉素耐藥基因分析.pdf

1、本文運用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)、抗生素選擇壓力、轉(zhuǎn)座子插入失活、E-test檢測等方法分析不同CLR濃度下篩選的耐藥HP菌株的發(fā)生機制，以期進一步發(fā)現(xiàn)新的CLR耐藥相關(guān)基因。 首先，以HP 26695為出發(fā)菌株，采用連續(xù)傳代法，在含CLR平皿上選擇耐藥突變體，提取全菌蛋白后通過雙向凝膠電泳(2-DE)分離蛋白，銀染后應(yīng)用2D-ImageMaster。軟件比較不同濃度CLR耐藥菌株和敏感菌株的蛋白表達差異，對部分表達差異的蛋白點進行膠內(nèi)酶

2、解，通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)進行鑒定，并在NCBI的HP蛋白數(shù)據(jù)庫中搜索理論上酶解肽段能與之相匹配的蛋白。結(jié)果顯示，共10個蛋白點在耐藥菌株與野生菌株以及不同濃度的耐藥菌株之間有明顯差異，其中3個蛋白點為DNA指導(dǎo)的RNA多聚酶α亞單位，其表達量和等電點在耐藥菌株與野生株之間存在明顯差異；1個蛋白點為黃素氧化還原蛋白，其在耐藥株中表達量上調(diào)；2個蛋白點為30S核糖體蛋白S1，其在耐藥株中表達量下調(diào)

3、：3個蛋白點為過氧化氫酶，其在耐藥株中表達量上調(diào)。以上9個蛋白點只在耐藥株與野生株間存在差異，不同濃度耐藥菌株之間變化趨勢一致。然而細胞分裂抑制劑在不同濃度藥株間表達量卻不相同，具體為低濃度CLR耐藥株較野生株表達量上調(diào)，而高濃度耐CLR菌株較野生株表達量下調(diào)，說明不同濃度耐藥株的耐藥機制有不同的相關(guān)靶點。這對于研究HP23S rRNA外CLR的耐藥機制提供了線索。在蛋白表達水平尋找到部分差異的同時，本實驗采用帶有氯霉素標簽可以隨機在染

4、色體上插入的轉(zhuǎn)座子(TN5)作為研究的主要工具，成功建立了一個全基因組隨機插入失活的HP突變體庫，尋找到新的CLR耐藥相關(guān)基因—HP1469。該基因編碼外膜蛋白Omp31，后者屬于Hop家族，是一種膜孔蛋白，與物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運相關(guān)。 為驗證23S rRNA、HPl469與臨床CLR敏感及耐藥菌株的關(guān)系，采用隨機對照研究方法對兩種常用含克拉霉素的HP根除治療方案的療效進行對比，得出結(jié)論：①建議以PPI聯(lián)合克拉霉素、阿莫西林為根除HP

5、的一線治療方案；②HP對CLR原發(fā)耐藥率20.5％，繼發(fā)耐藥率36.4％。爾后通過測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)：①實驗室壓力選擇耐藥株無23S rRNA 2115，2141，2142，2143點突變；臨床分離耐藥株也無以上4點的點突變；原發(fā)耐藥株存在2147A/G，2186T/C，2244G/A SNP，繼發(fā)耐藥株存在2186T/C SNP：②原發(fā)CLR耐藥菌株和繼發(fā)CLR耐藥菌株的OMP31氨基酸序列同源性較CLR敏感菌株低，但統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，CLR

6、敏感菌株與原發(fā)CLR耐藥菌株及繼發(fā)CLR耐藥菌株兩兩比較，無顯著差異。氨基酸差異分析表明，耐藥菌株主要表現(xiàn)在第100位氨基酸門冬氨酸、第113位氨基酸天冬酰胺、第173位氨基酸組氨酸的替換。 同時，本實驗直接取<'14>C-UBT及RUT同時陽性患者的胃黏膜組織，提取DNA后以HP的基因序列(如23SrRNA)鑒定，PCR方法擴增出目的片段HP1469,測序結(jié)果顯示，胃粘膜來源及菌株來源的OMP31氨基酸序列與標準的OMP31氨