抗AβN端表位單克隆抗體的體外保護(hù)作用及其在Aβ檢測(cè)中的初步應(yīng)用.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease， AD)是一種比較常見的衰老相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，目前尚無(wú)特異的治療和診斷方法。AD的主要病理特征是細(xì)胞外淀粉樣肽（amyloidβ-peptide, Aβ）沉積形成老年斑（senile plaque， SP）、細(xì)胞內(nèi)tau蛋白積聚形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle, NFT)以及神經(jīng)元丟失及腦萎縮。目前認(rèn)為，Aβ異常折疊和聚集是其神經(jīng)元損傷作用的主要始

2、動(dòng)環(huán)節(jié)，形成的Aβ寡聚體主要以C端肽為核心，而將N端肽暴露于表面。研究表明，針對(duì)Aβ不同肽段的單抗在AD治療和早期診斷中具有各自的優(yōu)勢(shì)，而針對(duì)AβN端的單抗通常親和力較高，比較適合用于AD的診斷和治療研究。
　　 本課題主要研究了具有N端表位的抗Aβ單抗體外細(xì)胞保護(hù)作用以及此類抗體在AD檢測(cè)中的初步應(yīng)用。
　　 一、針對(duì)N端表位的抗Aβ單克隆抗體的體外保護(hù)作用
　　 首先，選擇反式視黃酸(Trans Retino

3、ic Acid, TRA)作為分化誘導(dǎo)劑，用可溶性Aβ寡聚體引起神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞損傷，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并用MTT法測(cè)定細(xì)胞活力，建立較穩(wěn)定的Aβ體外細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)體系。然后，利用本實(shí)驗(yàn)室保存的3株針對(duì)不同位點(diǎn)的N端表位Aβ單抗，分別為抗人Aβ寡聚體單抗A8（表位Aβ1-6）、A6F7（表位Aβ1-11）和抗人Aβ單抗C9（表位Aβ4-11），研究具有N端表位的抗Aβ單抗對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞的體外保護(hù)

4、作用。結(jié)果顯示：(1)與對(duì)照組相比，對(duì)TRA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞，低劑量Aβ寡聚體(10μM)即可引起細(xì)胞活力降低(p＜0.05)；而對(duì)未用TRA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞，高劑量Aβ寡聚體(20μM)，尚未引起明顯的細(xì)胞毒性(p＞0.05)。說(shuō)明誘導(dǎo)分化是Aβ寡聚體在體外引起SH-SY5Y細(xì)胞毒性的重要條件。(2)設(shè)置0、2、4、6、8、10、12、14、20μM Aβ寡聚體實(shí)驗(yàn)組，發(fā)現(xiàn)當(dāng)加入10μM Aβ寡聚體可得到顯著性毒性作用

5、(p＜0.01)，細(xì)胞形態(tài)變化明顯；當(dāng)Aβ寡聚體濃度增加時(shí)，毒性更加明顯。說(shuō)明Aβ寡聚體誘導(dǎo)細(xì)胞毒性具有劑量依賴性。(3)誘導(dǎo)后，1μMA8、A6F7和C9這3株單抗均可顯著降低Aβ寡聚體對(duì)細(xì)胞的毒性作用(p＜0.05)。但3株單抗之間的保護(hù)作用差異不顯著(p＞0.05)。
　　 二、針對(duì)N端表位的抗Aβ單克隆抗體在Aβ檢測(cè)中的初步應(yīng)用
　　 以活化生物素標(biāo)記單抗A8，利用間接ELISA測(cè)定生物素化A8的最佳稀釋度。以體

6、外聚集的Aβ寡聚體作為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品，分別用單抗A6F7（表位Aβ1-11）、C9（表位Aβ1-6）和4G8（表位Aβ17-28）作為包被抗體，用生物素化A8作為檢測(cè)抗體，用親和素-辣根過(guò)氧化物酶作為檢測(cè)系統(tǒng)，建立Aβ寡聚體標(biāo)準(zhǔn)品的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)體系。然后利用此體系對(duì)AD病人外周血標(biāo)本進(jìn)行初步檢測(cè)。結(jié)果顯示：(1) Aβ寡聚體標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)體系中，生物素化A8的最佳稀釋度為1:800；4G8(1:800)作為包被抗體時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)效

7、果優(yōu)于A6F7、或C9做包被抗體。(2)利用此檢測(cè)體系，建立雙抗體夾心Aβ42標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍在0.33-19.5 ng/mL，靈敏度為330 pg/mL。(3)用這種方法初步檢測(cè)了12例AD患者及2例同齡的正常對(duì)照血漿中Aβ含量，AD患者組為（52.2士11.3）ng/mL，同齡對(duì)照組為（12.5士9.6）ng/mL, AD患者組血漿中β淀粉樣肽含量是同齡對(duì)照組人數(shù)的4.16倍。
　　 綜上，本研究建立了較為穩(wěn)定