皂莢提取物對肝癌細胞小鼠TGF-β-Smads信號系統(tǒng)調(diào)控的影響.pdf

1、目的：通過研究皂莢提取物(乙酸乙酯提取)對小鼠肝癌細胞TGF-β/Smads信號系統(tǒng)調(diào)控的影響，為皂莢提取物(乙酸乙酯提取)是否具有抗肝癌的作用提供參考。
　　 方法：
　　 第一部分：理論探討
　　 1從中醫(yī)理論上闡明痰和腫瘤的關(guān)系。強調(diào)痰、毒和瘀相互影響、相互轉(zhuǎn)化、相互膠著是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵。
　　 2提出從“痰”論治肝癌的可行性。并闡明化痰藥口皂莢”具有抗癌作用的前期研究依據(jù)。
　　 第

2、二部分：皂莢的文獻研究
　　 從皂莢的一般特性研究；皂莢的歷史研究探討；含有皂莢的方劑研究；皂莢的藥理學(xué)研究和皂莢的臨床應(yīng)用等方面闡明皂莢的特點和研究價值。
　　 第三部分：實驗研究
　　 我們采用清潔級的昆明種小鼠60只。通過隨機方法(隨機數(shù)字表法)將實驗動物分為6組，實驗分為陰性對照組(吐溫80溶劑)；皂莢提取物(乙酸乙酯提取)3個濃度組(26.0mg/d、13.0mg/d、7.8mg/d)；陽性對照組(金龍

3、膠囊組)；空白對照組(不造模組)。每組10只小鼠。造模采用小鼠右腋皮下接種H22肝癌細胞懸液的方法。造模后第2天到第16天，按實驗分組和要求(每只灌胃量為0.4m1，已經(jīng)配好濃度)進行灌胃。造模后第17天處死小鼠，收集標(biāo)本進行各項檢查。實驗一：觀察各組小鼠大體情況；各組小鼠死亡率；各組小鼠剝瘤稱重，計算各組腫瘤抑制率和病理學(xué)觀察。實驗二：檢測各組小鼠血清中的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)，堿性磷酸酶(ALP)，總蛋白(TP)，白蛋白(ALB

4、)和甲胎蛋白(AFP)的濃度。實驗三：實時熒光定量的方法檢測各組小鼠肝臟組織中的Smad4mRNA和Smad7mRNA的表達。實驗四：免疫組化的方法檢測Smad4和Smad7蛋白質(zhì)的表達。
　　 結(jié)果：
　　 實驗一：皂莢提取物對接種H22肝癌細胞荷瘤小鼠一般生物學(xué)特性和病理學(xué)的觀察
　　 1鼠大體觀察：空白對照組小鼠活動正常，精神狀態(tài)很好，毛發(fā)正常，并且有光澤，飲食正常，大小便正常。皂莢提取物(高劑量組)，皂莢

5、提取物(中劑量組)，皂莢提取物(低劑量組)和陽性對照組(金龍膠囊組)，各組小鼠毛發(fā)脫落、有稀疏感、光澤度欠佳，精神不振，活動明顯減少，飲食較空白對照組明顯減少，飲水少較空白對照組明顯減少不明顯，大小便情況較空白對照組少，對外界反應(yīng)慢。陰性對照組(溶劑土溫80)的情況類似。右側(cè)前肢接種H22肝癌細胞的小鼠，接種部位可見大小不等的腫塊。有部分小鼠腹腔部位出現(xiàn)腹部脹大，用指尖觸診，有明顯波動感，考慮為形成的腹水。
　　 2昆明種小鼠的

6、死亡率達21.67％。
　　 3各組小鼠腫瘤重量比較：皂莢提取物(高)平均腫瘤重量2.87±0.34，皂莢提取物(中)平均腫瘤重量3.68±0.34，皂莢提取物(低)平均腫瘤重量3.64±0.36，陽性對照組平均腫瘤重量2.60±0.36與陰性對照組平均腫瘤重量4.73±0.40比較明顯降低，P＜0.01；陰性對照組，皂莢提取物(中)，皂莢提取物(低)與陽性對照組比較明顯增高，P＜0.01；皂莢提取物(高)與陽性對照組比較腫瘤重

7、量無統(tǒng)計學(xué)差異，P＞0.05。
　　 各組小鼠腫瘤抑制率：陽性對照組為45％；陰性對照組為0；皂莢提取物高劑量組39％；皂莢提取物中劑量組22％；皂莢提取物低劑量組為23％。
　　 4病理學(xué)觀察：空白對照組小鼠肝臟的肉眼和顯微鏡下觀察都表現(xiàn)正常，模型組各組小鼠總體上較空白對照組(非模型組)有更多的不正常的表現(xiàn)。
　　 陰性對照組，皂莢提取物中劑量組和皂莢提取物低劑量組病理學(xué)觀察：肉眼大體觀察：小鼠的肝臟體積較空白

8、對照組小鼠明顯增大；質(zhì)地較空白對照組硬度增強；肝臟表面可見多個散在的灰白結(jié)節(jié)。陰性對照組最多，皂莢提取物中劑量組和皂莢提取物低劑量組比陰性對照組略少。光學(xué)顯微鏡下：肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰，肝細胞索排列不整齊。細胞核形態(tài)明顯異常，肝細胞有部分細胞核增大，或核質(zhì)比例增大。
　　 陽性對照組，皂莢提取物高劑量組病理學(xué)觀察：肉眼大體觀察：小鼠的肝臟體積較空白對照組小鼠略有增大；質(zhì)地較空白對照組硬度略有增強，但不及陰性對照組；肝臟表面可以偶見散

9、在的灰白結(jié)節(jié)。陽性對照組和皂莢提取物高劑量組沒有明顯差別。光學(xué)顯微鏡下：肝小葉結(jié)構(gòu)欠清晰，肝細胞索排列不整齊。細胞核形態(tài)異常不明顯。推測皂莢提取物高劑量組能通過對肝癌癌瘤有明顯抑制癌細胞生長的作用，從而延緩肝癌細胞造成肝臟組織的進一步損傷，從而起到保護肝臟的目的。
　　 實驗二：皂莢提取物對接種H22肝癌細胞荷瘤小鼠肝功能相關(guān)指標(biāo)的影響
　　 小鼠血清GGT水平：陽性對照組平均值23±2U/L、皂莢提取物組(高)平均值2

10、3±2 U/L與陰性對照組平均值38±2U/L比較明顯降低，P＜0.01；皂莢提取物組(中)平均值27±2U/L，皂莢提取物組(低)平均值37±2U/L與陰性對照組平均值比較降低P＜0.05。皂莢提取物組(中)平均值，皂莢提取物組(低)平均值，陰性對照組平均值與陽性對照組平均值比較明顯降低，P＜0.01。
　　 小鼠血清ALP水平：陽性對照組平均值25±5 IU/L、皂莢提取物組(高)平均值34±6 IU/L、皂莢提取物組(中)

11、平均值56土5 IU/L與陰性對照組平均值90±8 IU/L比較明顯降低，P＜0.01；皂莢提取物組(低)平均值75±7水平于陰性對照組比較降低P＜0.05。皂莢提取物組(高)、皂莢提取物組(中)，皂莢提取物組(低)，陰性對照組ALP水平于陽性對照組比較明顯降低，P＜0.01。
　　 小鼠血清TP：陽性對照組平均值70±2、皂莢提取物組(高)平均值65±6、皂莢提取物組(中)平均值59±3和皂莢提取物組(低)平均值58±3的TP

12、水平于陰性對照組平均值47±4比較明顯增高，P＜0.01；。皂莢提取物組(中)，皂莢提取物組(低)和陰性對照組的TP水平于陽性對照組比較明顯降低，P＜0.01。
　　 小鼠血清ALB：陽性對照組平均值30±2、皂莢提取物組(高)平均值29±1的小鼠ALB水平于陰性對照組平均值22±2比較明顯增高，P＜0.01。皂莢提取物組(中)平均值25±3，皂莢提取物組(低)平均值23±2和陰性對照組的小鼠ALB水平于陽性對照組比較明顯降低，

13、P＜0.01。
　　 小鼠血清AFP：結(jié)果各組小鼠AFP的數(shù)值均沒有測出。實驗三：皂莢提取物對接種H22肝癌細胞荷瘤小鼠TGF-β/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路smad4 mRNA和smd7 mRNA表達的影響
　　 Smad4mRNA表達：擴增倍數(shù)陽性對照組平均值0.566±0.092和皂莢提取物高劑量組平均值0.471±0.069與陰性對照組平均值0.320±0.099比較明顯增高，P＜0.01；皂莢提取物中劑量組平均值0

14、.363±0.058和皂莢提取物低劑量組平均值0.280±0.067與陽性對照組比較比較明顯降低，P＜0.01。
　　 Smad7mRNA表達：擴增倍數(shù)陽性對照組平均值2.007±0.499、皂莢提取物組(高劑量組)平均值2.230±0.491的小鼠肝臟組織中Smad7mRNA表達水平于陰性對照組平均值3.537±0.401比較明顯降低，P＜0.01。
　　 皂莢提取物組(中劑量組)平均值3.106±0.410，皂莢提取

15、物組(低劑量組)平均值3.613±0.416和陰性對照組小鼠肝組織中Smad7mRNA表達水平于陽性對照組比較明顯增高，P＜0.01。
　　 實驗四：皂莢提取物對接種H22肝癌細胞荷瘤小鼠TGF-β/Smds信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路smd4和smd7蛋白表達的影響
　　 Smd4蛋白表達：陽性對照組的小鼠肝臟Smad4蛋白表達水平平均值2973.190±248.540與陰性對照組平均值1196.399±837比較明顯增高，P＜0.0

16、1。皂莢提取物組(高劑量組)平均值2295.187±820.119與陰性對照組比較增高，P＜0.05。
　　 陰性對照組的小鼠肝臟Smad4蛋白表達水平與陽性對照組比較明顯降低，P＜0.01。皂莢提取物組(中劑量組)平均值1558.835土302.801和皂莢提取物組(低劑量組)平均值988.614±338.995與陽性對照組比較降低，P＜0.05。
　　 Smad7蛋白表達：陽性對照組平均值1454.381±302.4

17、05和皂莢提取物組(高劑量組)平均值1494.202±399.553的小鼠肝臟Smad7蛋白表達水平與陰性對照組平均值2239.589±272.892比較明顯降低，P＜0.01。皂莢提取物組(中劑量組)平均值1496.981±505.121與陰性對照組比較降低，P＜0.05。
　　 陰性對照組和皂莢提取物組(低劑量組)平均值2330.056±177.105的小鼠肝臟Smad7蛋白表達水平與陽性對照組比較明顯增高，P＜0.01。<

18、br>　　 結(jié)論：皂莢提取物(乙酸乙酯提取)的抗肝癌的作用可能有下列機理實現(xiàn)：①改善荷瘤小鼠的生存質(zhì)量而抑制腫瘤對機體的損傷。②通過抑制接種部位腫瘤體的大小而起到抗癌的作用。③通過保護荷瘤小鼠的肝臟功能而起到保護肝臟的作用④皂莢提取物高劑量組(26.0mg/d)能通過增強Smad4mRNA的表達和下調(diào)Smad7mRNA的表達。⑤皂莢提取物高劑量組(26.0mg/d)能通過增強Smad4蛋白的表達和下調(diào)Smad7蛋白的表達。綜合起到抗癌