免疫磁珠分離聯合涂片、PCR法檢測痰內結核分枝桿菌的方法學研究與評價.pdf

1、目的：
　　 肺結核是嚴重的公共衛(wèi)生問題。其傳播范圍廣、早期無癥狀、無有效疫苗等特點決定了對此病最有效的預防干預措施是及時發(fā)現并治療患者。長期以來，結核菌的檢測技術沒有顯著的進步，傳統(tǒng)的涂片抗酸染色鏡檢法和聚合酶鏈反應（PCR）仍是目前最常用檢測方法，兩種方法都存在缺陷，前者敏感性低、后者易出現假陰性和假陽性都是長期困擾防癆工作者問題，傳統(tǒng)方法已不能滿足當前結核病防治工作的需要。免疫磁珠分離技術（IMS）是一種有效的分離手段，在

2、免疫檢測、細胞及微生物分離、大分子物質純化等領域得到越來越廣泛的應用。本次研究旨在建立起免疫磁珠從痰液中分離結核桿菌的方法，并探討其與傳統(tǒng)的結核桿菌檢測方法，包括涂片抗酸染色鏡檢和常規(guī)PCR檢測，聯合應用時對肺結核的診斷價值。
　　 方法：
　　 將人型結核分枝桿菌標準菌株H37Rv的純培養(yǎng)物超聲破碎制各菌體粗抗原，免疫新西蘭大白兔獲得多克隆抗血清，純化血清IgG，經分析后直接包被于活化磁珠表面，并確定抗體包被磁珠的最適

3、濃度、最佳包被時間。通過探索合適的痰液處理方法、免疫磁珠分離痰樣的最佳pH值和最佳分離時間，建立起免疫磁珠從痰液中分離結核分枝桿菌方法。
　　 利用建立的免疫磁珠分離技術分離臨床痰樣品中的結核桿菌后，再進行涂片染色鏡檢和PCR檢測，通過比較免疫磁珠分離前后涂片和PCR法的檢出率、靈敏度、特異度等指標，評價新建檢測方法的應用價值。
　　 結果：
　　 本次研究制備的多克隆抗體效價為1:16000，SDS-PAGE電

4、泳結果顯示其純化后具有良好的電泳純度，抗血清中IgG濃度為1.05μg/μl。偶聯時抗體與磁珠的最適比例為0.64μg/107個磁珠，包被時間以18h為佳，檢測下限為103個菌/ml。通過試驗，每毫升處理過的樣品中加入磁珠的數目不少于2x107，磁珠與處理后的樣品反應30min左右可達到較好的分離效果。
　　 對痰內結核桿菌進行直接涂片、PCR檢測及磁珠分離后再對分離物進行涂片、PCR檢測，檢出率分別為14.36％、18.78％

5、、37.02％及50.83％。以培養(yǎng)法作為參考標準，直接涂片與磁珠分離后涂片法的靈敏度分別為36.92％和52.31％，后者較前者提高15.39％。以綜合診斷指標做為參考標準，磁珠分離后涂片較直接涂片法靈敏度提高6.15％，磁珠分離后PCR較直接PCR檢測的靈敏度提高20.77％。
　　 結論：
　　 本研究使用自制抗體包被的免疫磁珠，能有效分離出痰內的結核分枝桿菌；免疫磁珠分離技術與涂片法、PCR法聯合使用，可提高后兩