人臍血細胞靜脈輸注對血管性癡呆大鼠治療作用的研究.pdf

1、背景與目的：哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralneuralsystem,CNS)受損后的修復(fù)是有限的，受損的神經(jīng)元幾乎不能再生。目前，越來越多的研究將精力集中在細胞移植治療腦和脊髓病變方面。胚胎干細胞移植是治療CNS疾病最有希望的手段之一，但其廣泛應(yīng)用受到組織來源、免疫排斥及倫理學等諸方面的限制。骨髓干細胞在體外經(jīng)過一定條件培養(yǎng)可以表達nestin抗原并可以分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞。骨髓干細胞已經(jīng)在CNS疾病如腦缺血及外傷等治療方面得到

2、了應(yīng)用。將骨髓間充質(zhì)干細胞(Mesenchymalstemcells，MSCs)移植到受損動物的CNS可以生長成為神經(jīng)元。與骨髓及外周血相比，臍血具有免疫原性弱、淋巴細胞不成熟、來源豐富、易于采集及保存、無腫瘤細胞污染等優(yōu)點。臍血較骨髓含有更多的干細胞，而且這些干細胞更原始，提示臍血源性干細胞比骨髓源性干細胞更有治療應(yīng)用價值。目前也有報道將人臍血細胞(humanumbilicalcordbloodcells，HUCBCs)移植到CNS受

3、損(如腦缺血或脊髓損傷)的動物模型中，從組織學及行為學改善方面證實了其有效性。血管性癡呆(vasculardementia，VaD)是指由于腦血管疾病引起的腦組織梗塞、低灌注或出血所致的認知功能損害綜合征。目前，VaD成為老年期癡呆的第二大病因，僅次于阿爾茨海默病(Alzheimerdisease，AD)。隨著人口老齡化和腦血管疾病發(fā)病率的上升，VaD的發(fā)病率也逐年上升。但對于VaD尚無特效治療方法。為此，本實驗擬初步觀察HUCBCs靜

4、脈輸注對VaD大鼠行為和認知功能的改善以及對腦組織保護及修復(fù)方面的作用。 方法：1.臍血的采集和分離選取健康無感染性疾病產(chǎn)婦，正常分娩的健康嬰兒做為臍血采集對象。采取健康成人外周血作為對照組。臍血與外周血均采集10份。以淋巴細胞密度梯度分離法對細胞進行分離。 2.細胞鑒定采集臍血，分離HUCBCs，對其進行nestin陽性細胞鑒定。以成人外周血細胞(Humanperipheralbloodcells，HUPBCs)作為對

5、照組。以免疫細胞化學的方法對HUCBCs中nestin陽性細胞進行定性檢測。采用流式細胞術(shù)對臍血細胞中nestin陽性細胞進行定量檢測；同時，采用流式細胞儀(flowcytometer，F(xiàn)CM)對HUCBCs和HUPBCs的細胞周期進行比較。 3.實驗動物分組大鼠隨機分為模型組(Modelgroup)、治療組(Treatmentgroup)、對照組(Controlgroup)，各組大鼠又分為2周(2W)、4周(4W)、8周(8W

6、)3個時相點。 4.動物模型采用改良的Pulsinelli's四血管阻斷(4VO)法制作動物模型。治療組于術(shù)后3小時內(nèi)由尾靜脈注射HUCBCs(3×106個/500μl)。應(yīng)用計算機控制的穿梭箱主動回避反應(yīng)(activeavoidanceresponse，AAR)檢測實驗大鼠的學習記憶能力。 5.大鼠腦組織內(nèi)的HUCBCs檢測采用免疫組織化學法對治療組大鼠腦組織內(nèi)HUCBCs進行定性檢測。 6.凋亡細胞檢測采用T

7、dT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標記(TerminaldeoxynucleotidyltransferasemediateddUPTnickend-labelling，TUNEL)法測定大鼠腦海馬組織的凋亡細胞。 7.血清NES、S-100蛋白含量檢測采用酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme-linkedimmunoadsordentassay，ELISA)法測定大鼠血清中神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuronspecificenolase，N

8、ES)和S-100蛋白含量。 8.病理學觀察以光鏡和透射電鏡觀察各組大鼠腦組織病理變化。 結(jié)果：1.免疫細胞化學定性檢測可見HUCBCs有nestin陽性染色細胞，對照組未見陽性染色細胞。FCM定量檢測顯示HUCBCs中nestin陽性細胞約占細胞總數(shù)的4％，細胞周期分析顯示HUCBCs處于S期的細胞數(shù)明顯高于HUPBCs；而HUCBCs處于G1/0期的細胞明顯少于HUPBCs。HUCBCs處于G2/M期的細胞高于HUP

9、BCs，但二者無顯著差異。 2.穿梭箱測試結(jié)果顯示HUCBCs治療對VaD大鼠的行為學有明顯改善作用。模型組和治療組術(shù)前與對照組大鼠AAR百分比無明顯差異。模型組術(shù)后各時相點大鼠AAR百分比較對照組顯著降低。治療組大鼠術(shù)后AAR百分比顯著低于對照組，但顯著高于模型組。 3.免疫組織化學方法分析顯示治療組大鼠腦組織中確有MAB-1281陽性細胞，說明HUCBCs能夠透過血腦屏障(bloodbrainbarrier,BBB)

10、進入大鼠腦中并存活。 4.對照組大鼠海馬僅見少量TUNEL陽性細胞。模型組大鼠海馬區(qū)TUNEL陽性細胞在術(shù)后2W最多，顯著高于對照組；術(shù)后4W、8W大鼠海馬TUNEL陽性細胞比例有所下降，但仍顯著高于對照組。治療組大鼠術(shù)后2W時TUNEL陽性細胞比例顯著高于對照組，4W、8W凋亡細胞比例與對照組比較已無顯著差異。治療組大鼠術(shù)后各時相點凋亡細胞比例均顯著低于模型組。 5.模型組大鼠術(shù)后2W血清NSE含量顯著高于對照組；4W

11、時與對照組無顯著差異；術(shù)后8W則顯著低于對照組。治療組大鼠術(shù)后2W血清NSE含量顯著低于模型組；術(shù)后4W、8W則顯著高于模型組。治療組大鼠術(shù)后各時相點血清NSE含量與對照組比較均無顯著差異。 6.模型組大鼠術(shù)后2W血清S-100蛋白含量高于對照組，相差非常顯著；術(shù)后4W、8W時血清S-100蛋白含量顯著高于對照組。治療組大鼠術(shù)后各時相點血清S-100蛋白含量均顯著低于模型組，與對照組比較均無顯著差異。 7.各組大鼠腦組織

12、病理學改變：模型組可見細胞核固縮，胞質(zhì)密度增高，線粒體腫脹，軸突水腫、變性、脫髓鞘等慢性缺血缺氧的病理改變。治療組上述改變明顯減輕，并可見處于修復(fù)過程中的有巨大核仁的細胞。 結(jié)論：1.本實驗證實HUCBCs確能表達nestin抗原，表明臍血細胞中存在具有神經(jīng)干細胞特性的細胞。這一結(jié)果為HUCBCs治療VaD提供了理論依據(jù)。 2.免疫組織化學方法證實HUCBCs能夠透過BBB進入VaD大鼠腦組織，并存活。 3.TU