血細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子SPIB在肺癌轉(zhuǎn)移中的功能研究.pdf

1、從組織學(xué)分類上看，肺癌主要包括小細胞肺癌與非小細胞肺癌兩個亞型。雖然前者的患病人數(shù)僅約為后者患病人數(shù)的四分之一，但是就惡性程度而言，小細胞肺癌易發(fā)生早期擴散，其預(yù)后不良程度遠遠超過非小細胞肺癌。因此，我們以小細胞肺癌為模型，研究腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機制。
　　SPIB基因?qū)儆贓TS轉(zhuǎn)錄因子家族，主要表達于造血系統(tǒng)，對于淋巴細胞與漿細胞樣樹突狀細胞的發(fā)育與功能特化起到重要的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)在多種淋巴瘤或白血病例當中，SPIB表達水平均發(fā)

2、生了異常性的升高或下降，說明SPIB表達異常與血細胞轉(zhuǎn)化相關(guān)。2005年，Tonon et al報道在肺癌基因表達譜中檢測到SPIB轉(zhuǎn)錄本異常升高，提示SPIB的表達不僅僅與血液系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生相關(guān)，有可能對實體腫瘤的發(fā)生也產(chǎn)生作用。然而，關(guān)于SPIB在實體腫瘤中異位表達對實體腫瘤發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移的影響，目前仍不清楚。
　　研究目的:
　　通過體內(nèi)和體外實驗闡明小細胞肺癌細胞特異性表達蛋白SPIB對肺癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)

3、移的影響及作用機制，以期為肺癌的臨床診治提供新的分子標記物和新的治療靶點。
　　研究方法與結(jié)果:
　　從小細胞肺癌細胞特異性表達的蛋白出發(fā)，以慢病毒載體系統(tǒng)，通過過表達或RNA干擾改變小細胞肺癌細胞與非小細胞肺癌細胞中SPIB蛋白的表達水平，觀察細胞生物學(xué)行為的變化，并結(jié)合小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移模型，探究其內(nèi)部的分子機制。
　　1、通過RNA-Sequencing技術(shù)對比了小細胞肺癌細胞株H209與非小細胞肺癌細胞株A549的基

4、因表達譜的差異，發(fā)現(xiàn)SPIB在A549細胞中表達量極低，而在H209細胞中高表達。
　　2、通過基于多種細胞系的針對于SPIB表達水平的RT-PCR檢測，確定SPIB在所有小細胞肺癌細胞（均為神經(jīng)內(nèi)分泌型）和神經(jīng)內(nèi)分泌型的非小細胞肺癌細胞中表達;另一方面，使用免疫組化技術(shù)，進一步檢測到SPIB蛋白高表達于臨床病人的小細胞肺癌組織樣本，且具有核定位現(xiàn)象，而非小細胞肺癌組織中僅個別低分化病例可見SPIB蛋白的表達。
　　3、利用

5、染色體免疫共沉淀技術(shù)，對比H209細胞株與A549細胞株中SPIB基因調(diào)控區(qū)組蛋白H3的修飾情況，發(fā)現(xiàn)SPIB的異位表達是由于表觀遺傳調(diào)控紊亂引起。
　　4、以慢病毒為載體，下調(diào)H209細胞株的SPIB表達水平，以顯微鏡觀察細胞表型的變化，發(fā)現(xiàn)細胞間連接趨于緊密;以流式細胞儀檢測細胞活性的變化，檢測到凋亡峰明顯上升。實時定量PCR檢測到CLDN1、CLDN2和TJP1等Tightjunction相關(guān)基因的下調(diào)。
　　5、以慢

6、病毒為載體，上調(diào)A549細胞株的SPIB表達水平，以軟瓊脂成克隆實驗檢測細胞在非貼附狀態(tài)下的增殖狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)細胞趨于形成松散克隆;以Transwell實驗檢測細胞的體外侵襲能力，發(fā)現(xiàn)侵襲能力明顯上升。實時定量PCR檢測到CLDN1、CLDN2和TJP1等Tight junction相關(guān)基因的上調(diào)。
　　6、以慢病毒為載體，將SPIB過表達于小鼠LLC1細胞株，而后通過皮下注射的方式將細胞接種于C57BL/6小鼠的腋窩處，經(jīng)兩周時間將

7、原位腫瘤手術(shù)摘除，縫合小鼠傷口，后再經(jīng)兩周時間將小鼠處死，取小鼠肺部并固定。計數(shù)肺部腫瘤結(jié)節(jié)，發(fā)現(xiàn)過表達SPIB的LLC1細胞株能夠形成更多的轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)，且結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　研究結(jié)論:
　　血細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子SPIB異位表達于小細胞肺癌細胞，可能通過對Claudin-1、Claudin-2、ZO-1等Tight junction相關(guān)蛋白表達水平的下調(diào)影響細胞之間的緊密連接。此外，外源過表達SPIB還