HBV編碼的反式激活蛋白調(diào)控端粒酶活性的作用及機(jī)制研究鼠α白蛋白表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、乙型肝炎病毒Htepatitis B Virus，HBV）感染肝細(xì)胞所致急慢性肝炎及相關(guān)肝硬化、肝細(xì)胞肝癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）是危害全世界，尤其是我國(guó)人民身心健康的重要病因。深入闡明HBV致癌機(jī)制，必將為預(yù)防和控制肝癌的發(fā)生發(fā)展提供強(qiáng)有力的手段。目前HBV致癌的確切機(jī)理尚未完全清楚，但HBV DNA整合及整合后通過(guò)反式激活作用致癌的論點(diǎn)已成為大多數(shù)學(xué)者的共識(shí)。有研究表明在不同的HBV相關(guān)HCC組織

2、中，端粒酶編碼基因內(nèi)存在HBV基因片段的整合。這些整合的HBV基因可激活人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（humall telomerase reverse tramscriptase，hTERT），上調(diào)端粒酶活性，促進(jìn)肝癌的發(fā)生。 端粒酶（telomerase）位于端粒末端，是一種特殊的核糖核蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶，大多數(shù)正常體細(xì)胞不表達(dá)端粒酶活性，而在惡性腫瘤中端粒酶活性高表達(dá)。研究表明一些病毒編碼的蛋白，可通過(guò)激活端粒酶來(lái)維持端粒長(zhǎng)度，阻止細(xì)胞死亡

3、，來(lái)促進(jìn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化與腫瘤的發(fā)生。 HBx與PreS2作為HBV基因編碼的兩種重要轉(zhuǎn)錄激活蛋白，在HBV相關(guān)肝癌中的整合率遠(yuǎn)大于其他蛋白，被認(rèn)為在HBV相關(guān)肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用。而這兩種HBV基因編碼的重要轉(zhuǎn)錄激活因子，能否上調(diào)端粒酶活性，反式激活hTERT啟動(dòng)子促進(jìn)hTERT轉(zhuǎn)錄，以及通過(guò)哪些元件激活hTERT啟動(dòng)子，目前還尚未有相關(guān)報(bào)道。因此，在前期工作的基礎(chǔ)上，本課題在國(guó)內(nèi)外率先開(kāi)展了有關(guān)HBV編碼反式激活蛋

4、白調(diào)控hTERT轉(zhuǎn)錄水平的作用及機(jī)制研究，為進(jìn)一步闡明HBV感染相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。 目的： 1.研究HBx與PreS2蛋白能否促進(jìn)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶表達(dá)，上調(diào)端粒酶活性。 2.研究HBx促進(jìn)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因表達(dá)的機(jī)制，篩選HBx作用于hTERT啟動(dòng)子上關(guān)鍵位點(diǎn) 3.篩選調(diào)控hTERT啟動(dòng)子的HBx關(guān)鍵區(qū)段 方法： 1.HBx及PreS2蛋白對(duì)端粒酶活性及hTERT基因表達(dá)的

5、影響 1.1過(guò)表達(dá)HBx及PreS2蛋白對(duì)肝癌細(xì)胞端粒酶活性的影響 提取pcDNA3-HBx及空載體對(duì)照pcDNA3瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組HepG2細(xì)胞總蛋白；提取穩(wěn)定表達(dá)preS2的HepG2肝癌細(xì)胞總蛋白；設(shè)立293細(xì)胞為端粒酶活性陽(yáng)性對(duì)照組。85℃加熱10分鐘，滅活293細(xì)胞蛋白中端粒酶活性，設(shè)為端粒酶活性陰性對(duì)照。TRAP法檢測(cè)端粒酶活性。 1.2過(guò)表達(dá)HBx及PreS2蛋白對(duì)肝癌細(xì)胞hTERT基因m

6、RSA水平表達(dá)的影響半定量RT-PCR分別檢測(cè)pcDNA3-HBx、pcDNA3瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞中hTERT mRNA的表達(dá)。 半定量RT-PCR分別檢測(cè)穩(wěn)定表達(dá)preS2的HepG2細(xì)胞、pcDNA3空載體對(duì)照組細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞中hTERT mRNA的表達(dá)。 1.3反義封閉HBx與PreS2基因表達(dá)對(duì)hTERT基因mRSA水平的調(diào)控作用設(shè)計(jì)合成針對(duì)HBx、PreS2的硫代反義寡核苷酸PS-asO

7、DNs/HBx、PS-asODNs/preS2及無(wú)關(guān)對(duì)照硫代寡核苷酸PS-asRandom，并以陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的方式分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞系，作用48h后，半定量RT-PCR分別檢測(cè)各反義寡核苷酸作用組及空細(xì)胞對(duì)照組hTERT mRNA的表達(dá)。 2.HBx對(duì)hTERT啟動(dòng)子的調(diào)控作用 2.1系列缺失及突變hTERT啟動(dòng)子報(bào)告載體的構(gòu)建 設(shè)計(jì)、合成針對(duì)hTERT啟動(dòng)子不同片段及突變序列的特異性引物，

8、以pCR-TRTP為模板，PCR擴(kuò)增獲得hTERT啟動(dòng)子系列缺失及突變序列的基因。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)酶切定向插入報(bào)告基因載體pGL3-basic內(nèi)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109，經(jīng)抗性篩選、酶切、PCR、DNA測(cè)序鑒定獲得陽(yáng)性重組子。 2.2 HBx對(duì)全長(zhǎng)hTERT啟動(dòng)子的調(diào)控作用 將不同劑量的重組子pcDNA3-HBx與攜帶有hTERT啟動(dòng)子的報(bào)告質(zhì)粒pGL3B-TRTP共轉(zhuǎn)染不同細(xì)胞系，同時(shí)轉(zhuǎn)染pRL-tk作為內(nèi)參

9、照。pGL3B-TRTP可在hTERT啟動(dòng)子的作用下表達(dá)螢火蟲(chóng)熒光素酶，而pRL-tk可表達(dá)海腎熒光素酶。36h后，收集并裂解細(xì)胞，測(cè)定雙熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。 2.3 HBx作用于hTERT啟動(dòng)子關(guān)鍵區(qū)域的尋找 將HBx表達(dá)載體與系列缺失hTERT啟動(dòng)子報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染，36h后，收集并裂解細(xì)胞，測(cè)定雙熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 2.4 HBx作用于hTERT啟動(dòng)子

10、關(guān)鍵位點(diǎn)的尋找 將HBx表達(dá)載體與系列突變hTERT啟動(dòng)子報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染，36h后，收集并裂解細(xì)胞，測(cè)定雙熒光素酶表達(dá)量，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 2.5 HBx轉(zhuǎn)染前后對(duì)Sp1表達(dá)水平的影響 提取pcDNA-HBx及pcDNA3瞬時(shí)轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞的各組細(xì)胞總蛋白及總RNA，Western blot及RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中Sp1，HBx和β-actin的表達(dá)水平。 3.調(diào)控hTERT啟動(dòng)子的最

11、小HBx關(guān)鍵區(qū)域的尋找 3.1截短型HBx重組子的構(gòu)建 設(shè)計(jì)、合成針對(duì)HBx不同片段基因序列的特異性引物，以pcDNA3-HBx為模板，PCR擴(kuò)增獲得HBx不同截短片段的基因。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)酶切定向克隆入雙酶切的pcDNA3-HBx載體內(nèi)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，經(jīng)抗性篩選、酶切、PCR及DNA測(cè)序鑒定獲得陽(yáng)性重組子。 3.2截短型HBx在細(xì)胞中的表達(dá) 系列截短型HBx重組子經(jīng)脂質(zhì)體包裹轉(zhuǎn)染He

12、pG2細(xì)胞系，48小時(shí)后，抽提各組細(xì)胞總蛋白與總RNA，Western blot或RT-PCR檢測(cè)截短型HBx的表達(dá)情況。 3.3系列截短型HBx對(duì)端粒酶啟動(dòng)子的作用 將系列截短型HBx重組子與攜帶有hTERT啟動(dòng)子的報(bào)告質(zhì)粒pGL3B-TRTP共轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系HepG2，同時(shí)轉(zhuǎn)染pRL-tk作為內(nèi)參照。36h后，收集并裂解細(xì)胞，測(cè)定雙熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)論: 1.通過(guò)過(guò)表達(dá)及反義封

13、閉實(shí)驗(yàn)，證實(shí)HBx及PreS2蛋白均可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞中hTERT mRNA表達(dá)，上調(diào)端粒酶活性。 2.HBx在不同細(xì)胞系以劑量依賴的方式激活hTERT啟動(dòng)子活性。 3.HBx通過(guò)hTERT啟動(dòng)子-197～+37激活其轉(zhuǎn)錄表達(dá)。 4.HBx通過(guò)Sp1結(jié)合位點(diǎn)，而不是C-myc結(jié)合位點(diǎn)發(fā)揮激活hTERT啟動(dòng)子的作用。 5.研究不同的截短型HBx對(duì)hTERT啟動(dòng)子的作用，初步找到激活hTERT啟動(dòng)子的HBx關(guān)鍵

14、區(qū)段在50～140aa區(qū)域內(nèi)。 意義: 該課題的完成不僅為HBV相關(guān)HCC機(jī)制的闡明提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為端粒酶調(diào)控研究提供新思路，并為HBV相關(guān)HCC的治療提供新的靶點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。 α白蛋白（α-albumin，又名afamin，簡(jiǎn)稱AFM）是第四個(gè)被鑒定的白蛋白家族成員，該家族成員還包含其他三種蛋白：白蛋白（albumin，簡(jiǎn)稱Alb），甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP），以及維他命D結(jié)

15、合蛋白（Vitamin D-binding protein，DBP）。白蛋白家族成員的編碼基因均位于人類第四對(duì)染色體的4q11-q22區(qū)域或小鼠第十四對(duì)染色體上，編碼蛋白具有相同的框架結(jié)構(gòu)，在轉(zhuǎn)運(yùn)血清蛋白中發(fā)揮重要的作用，主要在肝組織中表達(dá)。但這四個(gè)家族成員在肝臟的發(fā)育過(guò)程有不同的表達(dá)形式，因而白蛋白家族是研究肝臟特異性基因表達(dá)調(diào)控的重要模型。有研究表明AFP及AFM參與肝癌的發(fā)生。目前眾多國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)詳細(xì)研究了如何在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控Al