ERCC1、MT1H基因表達(dá)與晚期胃癌鉑類(lèi)繼發(fā)耐藥的相關(guān)性研究.pdf

1、胃癌是全世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,胃癌的發(fā)病率及死亡率均較高。胃癌早期診斷率低,缺乏特異性早期表現(xiàn),多數(shù)患者確診時(shí)已屬中晚期,失去手術(shù)根治機(jī)會(huì),預(yù)后極差,通常5年生存率不超過(guò)20％。鉑類(lèi)及氟尿嘧啶類(lèi)是胃癌新輔助化療、術(shù)后輔助化療及進(jìn)展期胃癌姑息治療等最常見(jiàn)的藥物。由于存在腫瘤細(xì)胞耐藥,尤其是腫瘤多藥耐藥(Multidrug resistance,MDR),嚴(yán)重影響了化療療效及預(yù)后。如何提高胃癌化療藥物的敏感性,提高化療療效是目前臨床

2、關(guān)注的焦點(diǎn)。
　　 腫瘤細(xì)胞耐藥與腫瘤細(xì)胞內(nèi)DNA損傷修復(fù)能力差異及細(xì)胞解毒體系巰基分子的過(guò)量表達(dá)有關(guān)。DNA損傷主要通過(guò)核苷酸切除修復(fù)(nucleotide excision repair,NER)途徑修復(fù),而切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(excision repair cross-complementing gene1,ERCC1)在NER中起關(guān)鍵作用。ERCC1低表達(dá)可以使腫瘤的發(fā)生率增加,ERCC1過(guò)表達(dá)可對(duì)抗鉑類(lèi)的抗瘤效果。

3、ERCC1表達(dá)增強(qiáng)所致。DNA損傷修復(fù)能力的增強(qiáng)是腫瘤細(xì)胞對(duì)鉑類(lèi)耐藥的一大重要因?yàn)?。?xì)胞內(nèi)含巰基蛋白以金屬硫蛋白(metallothionein,MT)為主,MT是一類(lèi)低分子量、富含半胱氨酸、可被金屬誘導(dǎo)的特異蛋白質(zhì)。MT和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切,參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、分化,參與腫瘤耐藥,影響腫瘤的治療和預(yù)后。人MT基因包括10個(gè)功能性基因和7個(gè)非功能性基因。其中金屬硫蛋白1H(MT1H)是MT功能性基因之一,目前關(guān)于MT1H的資

4、料較少。現(xiàn)在研究較多的是腫瘤組織中ERCC1、MT。蛋白和mRNA的表達(dá)與化療耐藥及療效的關(guān)系,而外周血中ERCC1、MT1H的研究較少。鑒于此,本課題首先研究人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞中ERCC1、MT1H的表達(dá)在順鉑繼發(fā)耐藥中的作用,然后探討存在循環(huán)腫瘤細(xì)胞的晚期胃癌患者鉑類(lèi)化療前后外周血中ERCC1、MT1H的表達(dá)與鉑類(lèi)繼發(fā)耐藥的相關(guān)性及有關(guān)機(jī)制。
　　 第一部分：
　　 目的:研究順鉑對(duì)人胃腺癌SGC-7901

5、細(xì)胞株的殺傷作用及順鉑作用人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞后ERCC1、MT1H表達(dá)的變化,探討ERCC1、MT1H的表達(dá)與順鉑繼發(fā)耐藥的關(guān)系。
　　 方法:MTT法檢測(cè)順鉑對(duì)人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制率；采用半定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)不同時(shí)間、不同濃度順鉑作用后人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞中ERCC1、MT1H的表達(dá)情況。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行t檢驗(yàn),半定量結(jié)果用x±s表示,P<

6、0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.隨著DDP濃度的增加,對(duì)人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞的抑制作用逐漸增強(qiáng),24小時(shí)IC50=14μmol/L,48小時(shí)IC50=11μmol/L。
　　 2.DDP濃度為2.5μmol/L時(shí),人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞中ERCC1、MT1H表達(dá)開(kāi)始增高,隨著濃度的增加,其表達(dá)也增高,DDP濃度為40μmol/L時(shí)其表達(dá)最高,分別為對(duì)照組的2.19和2.82倍,與對(duì)照

7、組比較,差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001、P=0.005)。
　　 3.20μmol/LDDP作用12小時(shí)后人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞中ERCC1、MT1H的表達(dá)開(kāi)始增高,隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),其表達(dá)也增高,順鉑作用72小時(shí)其表達(dá)最高,分別為對(duì)照組的2.71和3.15倍,與對(duì)照組相比,差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005、P=0.001)。
　　 結(jié)論:順鉑對(duì)人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞的抑制作用呈劑量依賴(lài)性。隨著DDP

8、濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng),人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞中ERCC1、MT1H的表達(dá)增加,推測(cè)ERCC1、MT1H可能參與了順鉑的繼發(fā)耐藥。
　　 第二部分：
　　 目的:研究存在循環(huán)腫瘤細(xì)胞的晚期胃癌患者鉑類(lèi)化療前后外周血中ERCC1、MT1H的表達(dá)情況,進(jìn)一步探討ERCC1、MT1H的表達(dá)與胃癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系及與鉑類(lèi)繼發(fā)耐藥的相關(guān)性。
　　 方法:收集162例經(jīng)病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診的晚期胃癌患者化療前外周

9、血(15ml),通過(guò)8um孔徑,47mm直徑的濾膜過(guò)濾外周血(7.5ml),初步篩選分離腫瘤細(xì)胞,用細(xì)胞角蛋白8(CK8)抗體、二抗、白細(xì)胞共同抗原(CD45)抗體染色并用核酸染料4,6二脒基苯基吲哚(DAPI)染色細(xì)胞核后用激光掃描細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分析,選出DAPI+CK8+45-,再根據(jù)腫瘤細(xì)胞細(xì)胞核形態(tài)、大小最終確認(rèn)腫瘤細(xì)胞。選出存在循環(huán)腫瘤細(xì)胞的晚期胃癌患者,采用半定量RT-PCR檢測(cè)其含鉑方案化療前后外周血(7.5ml)中ERCC1

10、、MT1H的表達(dá)?；颊咄瓿?個(gè)周期化療后按照RECIST標(biāo)準(zhǔn)將患者分為有效組和無(wú)效組,比較化療前后ERCC1、MT1H的表達(dá)的變化。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行t檢驗(yàn)、x2檢驗(yàn),半定量結(jié)果用x±s表示,P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.激光掃描細(xì)胞計(jì)數(shù)儀掃描后應(yīng)用icys3.3軟件數(shù)據(jù)包進(jìn)行分析:選出DAPI+CK8+CD45-細(xì)胞且細(xì)胞核大、深染,呈高核漿比,胞漿內(nèi)CK8抗體染色呈典型

11、的環(huán)形或帽形,則確定為循環(huán)腫瘤細(xì)胞。162例患者晚期胃癌患者檢出循環(huán)腫瘤細(xì)胞的有108例,檢出率為66.67％。與健康對(duì)照組(檢出率為0)相比,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。
　　 2.108例晚期胃癌含鉑方案化療后,無(wú)完全緩解(CR)病例,部分緩解(PR)40例,穩(wěn)定(SD)38例,進(jìn)展(PD)30例,總有效率(CR+PR)為37.04％。
　　 3.108例晚期胃癌患者化療前外周血中ERCC1的表達(dá)與年齡、性別

12、、TNM分期無(wú)關(guān)(P>0.05),而與分化程度相關(guān)(P=0.002)。108例晚期胃癌患者中有76例外周血中ERCC1表達(dá)陽(yáng)性,陽(yáng)性率為70.37％。化療后ERCC1表達(dá)水平明顯高于化療前(P=0.000)。有效組與無(wú)效組化療前ERCC1表達(dá)水平的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.171)；有效組與無(wú)效組化療后ERCC1表達(dá)水平的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000);有效組化療前后ERCC1表達(dá)水平的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.105)；無(wú)效組化療

13、前后ERCC1表達(dá)水平的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。
　　 4.108例晚期胃癌患者化療前外周血中MT1H的表達(dá)與年齡、性別、TNM分期無(wú)關(guān)(P>0.05),而與分化程度有關(guān)(P=0.014)。108例晚期胃癌患者中有94例外周血中MT1H表達(dá)陽(yáng)性,陽(yáng)性率為87.04％。化療后MT1H表達(dá)水平明顯高于化療前(P=0.037)。有效組與無(wú)效組化療前、有效組與無(wú)效組化療后MT1H表達(dá)水平的差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.199、

14、P=0.118),有效組化療前后、無(wú)效組化療前后MT1H表達(dá)水平的差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.109、P=0.082)。
　　 結(jié)論:
　　 1.膜濾過(guò)聯(lián)合激光掃描細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)晚期胃癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法特異性高,可有效檢測(cè)晚期胃癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞,為腫瘤的早期診斷提供了一種新的簡(jiǎn)便有效的方法。
　　 2.晚期胃癌患者外周血中ERCC1、MT1H的表達(dá)與腫瘤的分化程度密切相關(guān),提示ERCC1、MT1H可能參與