重癥肺結(jié)核學(xué)免疫特性研究.pdf

1、目的：
　　1.應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)系統(tǒng)研究重癥肺結(jié)核與輕癥肺結(jié)核患者基因表達(dá)差異及其與疾病預(yù)后的關(guān)系。
　　2.研究重癥肺結(jié)核患者免疫應(yīng)答的特征及免疫機(jī)制，發(fā)現(xiàn)重癥肺結(jié)核病人免疫病理可能的分子基礎(chǔ)，為重癥肺結(jié)核患者免疫治療研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.確定患者入選標(biāo)準(zhǔn)和剔除標(biāo)準(zhǔn)。
　　2.標(biāo)本采集:收集解放軍309醫(yī)院結(jié)核病研究所住院患者及正常對(duì)照組外周血標(biāo)本，分離單個(gè)核細(xì)胞，用Trizol裂解后凍存，

2、送博奧公司做基因芯片表達(dá)譜分析。
　　3.基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)結(jié)果的數(shù)據(jù)分析和生物信息學(xué)分析。使用Cluster聚類分析軟件、SAM軟件、MAS分子注釋系統(tǒng)對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行聚類分析、差異基因篩選、差異基因的GO注釋和Pathway分析。
　　4.表達(dá)譜分析結(jié)果的驗(yàn)證。按照入選標(biāo)準(zhǔn)再次收集病例與正常對(duì)照標(biāo)本。用RT-PCR和ELISA方法驗(yàn)證芯片結(jié)果。
　　5.統(tǒng)計(jì)方法:用方差分析做數(shù)據(jù)方差齊性檢驗(yàn)，用非參數(shù)檢驗(yàn)做組間比較。

3、
　　結(jié)果：
　　1.基因表達(dá)譜芯片Cluster聚類分析顯示重癥與輕癥肺結(jié)核病人、正常對(duì)照組相比有明顯的表達(dá)差異基因。
　　2.用SAM軟件篩選差異表達(dá)基因，按照p＜0.05，比值≥2或≤0.5的標(biāo)準(zhǔn)，分組篩選結(jié)果顯示:輕癥與正常組相比下調(diào)基因12條;重癥與正常相比上調(diào)基因317條，下調(diào)基因350條;重癥與輕癥相比上調(diào)基因142條，下調(diào)基因263條。
　　3.MAS分子功能注釋系統(tǒng)做GO注釋顯示差異表達(dá)基因主要

4、涉及生物學(xué)過(guò)程。Pathway分析顯示重癥肺結(jié)核病人的差異表達(dá)基因參與有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)的信號(hào)通路共35條，主要涉及免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、組織損傷和重構(gòu)、凋亡與殺菌、物質(zhì)代謝等通路。
　　4.對(duì)候選基因用RT-PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果顯示:CCL3、IL-1β、c-Jun和CXCL2在重癥肺結(jié)核病人表達(dá)下調(diào)，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異(p＜0.05)，與芯片結(jié)果符合;用ELISA驗(yàn)證結(jié)果顯示CCL4和IL-1β表達(dá)下調(diào)，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差