阿托伐他汀和普伐他汀對(duì)醛固酮誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞ET-1-ET-AR和TGF-β1-TGF-βRI系統(tǒng)表達(dá)的影響及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究.pdf

1、本研究以培養(yǎng)的新生SD大鼠心臟成纖維細(xì)胞為研究靶細(xì)胞，采用放射免疫分析法、ELISA、流式細(xì)胞術(shù)、Western Blot和RT-PCR 技術(shù)動(dòng)態(tài)觀察了醛固酮誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞的ET-1/ET-AR和TGF-β1/TGF-βRⅠ系統(tǒng)表達(dá)的變化；同時(shí)觀察HMG-CoA還原酶抑制劑(阿托伐他汀和普伐他汀)對(duì)醛固酮誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞 ET-1/ET-AR和TGF-β1/TGF-βRⅠ系統(tǒng)表達(dá)的影響；還應(yīng)用Western blot技術(shù)測(cè)定心

2、臟成纖維細(xì)胞p44/42MAPK蛋白的表達(dá)，探討了阿托伐他汀、普伐他汀和醛固酮干預(yù)下心臟成纖維細(xì)胞。p44/42 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的變化。因此，本實(shí)驗(yàn)從mRNA表達(dá)、蛋白質(zhì)合成和分泌水平初步探討了阿托伐他汀、普伐他汀和醛固酮誘導(dǎo)大鼠心臟成纖維細(xì)胞ET-1/ET-AR和TGF-β1/TGF-βRⅠ系統(tǒng)表達(dá)的影響，了解其細(xì)胞分子生物學(xué)機(jī)制及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，為闡明心肌纖維化的發(fā)生機(jī)制，防治心肌纖維化提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)內(nèi)

3、容主要包括以下五部分： 第一部分：醛固酮對(duì)心臟成纖維細(xì)胞ET-1/ET-AR系統(tǒng)表達(dá)的影響 目的：醛固酮對(duì)新生大鼠心臟成纖維細(xì)胞ET-1/ET-AR系統(tǒng)表達(dá)的影響及其可能的作用機(jī)制。 方法：采用放射免疫分析法測(cè)定心臟成纖維細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)液中的ET，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心臟成纖維細(xì)胞ET-1，半定量RT-PCR 技術(shù)檢測(cè)心臟成纖維細(xì)胞ppET-1和ET-AR tuRNA表達(dá)的變化。 結(jié)果：1．醛固酮?jiǎng)┝恳蕾囆哉T導(dǎo)心

4、臟成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中ET水平的增加及螺內(nèi)酯的抑制作用：與正常對(duì)照組相比，醛固酮(10<'-9>、10<'-8>和10<'-7>mol/L)作用心臟成纖維細(xì)胞48 h，培養(yǎng)液中ET的水平明顯增加，且呈劑量依賴性(P<0.05、P<0.01和P<0.01)。以螺內(nèi)酯(10<'-6>mol/L)預(yù)處理心臟成纖維細(xì)胞2 h后，再加入醛固酮(10<'-7>mol/L)作用48 h后，培養(yǎng)液中ET 的水平與對(duì)照組相比無明顯差異；同時(shí)，單獨(dú)使用螺內(nèi)酯

5、(10<'-6>mol/L)并不改變培養(yǎng)液中ET的水平。 2．醛固酮?jiǎng)┝恳蕾囆哉T導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞中ET-1含量的增加及螺內(nèi)酯的抑制作用：與正常對(duì)照組相比，醛固酮(10<'-9>、10<'-8>和10<'-7>mol/L)作用心臟成纖維細(xì)胞24 h，心臟成纖維細(xì)胞中ET-1的含量明顯增加，且呈劑量依賴性(P<0.05、P<0.01和．P<0.01)；以螺內(nèi)酯(10<'-6>mol/L)預(yù)處理心臟成纖維細(xì)胞2 h后，再加入醛固酮(1

6、0<'-7>mol/L)作用24 h后，心臟成纖維細(xì)胞中ET-1表達(dá)與對(duì)照組相比無明顯差異；同時(shí)，單獨(dú)使用螺內(nèi)酯(10<'-6>mol/L)并不改變心臟成纖維細(xì)胞中ET-1的表達(dá)。 3．醛固酮誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞ppET-1 mRNA表達(dá)的時(shí)間效應(yīng)：在1％牛血清白蛋白心臟成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中加入醛固酮(10<'-7>mol/L)后0、1、2、4、和8 h，分別測(cè)定ppET-1 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示：在2 h時(shí)，ppET-1mR

7、NA表達(dá)明顯增加(P<0.01)，4 h達(dá)高峰(P<0.01)，以后逐漸下降。 4．醛固酮?jiǎng)┝恳蕾囆哉T導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞ppET-1 mRNA的表達(dá)及螺內(nèi)酯的抑制作用：與正常對(duì)照組相比，醛固酮(10<'-9>、10<'-8>和10<'-7>mol/L)作用心臟成纖維細(xì)胞4 h，ppET-1 mRNA表達(dá)明顯增加，且呈劑量依賴性(P<0.05、P<0.01和P<0.01)；以螺內(nèi)酯(10<'-6>mol/L)預(yù)處理心臟成纖維細(xì)胞2

8、h后，再加入醛固酮(10<'-7>mol/L)作用4 h后，ppET-1 mRNA表達(dá)與醛固酮(10<'-7>mol/L)組相比顯著降低，而與對(duì)照組相比無明顯差異；同時(shí)，單獨(dú)使用螺內(nèi)酯(10<'-6>mol/L)并不改變ppET-1 mRNA的表達(dá)。 5．醛固酮對(duì)心臟成纖維細(xì)胞ET-AR mRNA表達(dá)的時(shí)間過程：在1％牛血清白蛋白培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中加入醛固酮(10<'-7>mol/L)后0、1、2、4和8 h，分別測(cè)定

9、ET-AR mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示：在正常對(duì)照組(0 h)心臟成纖維細(xì)胞表達(dá)少量的：ET-AR mRNA。給予醛固酮1 h后，ET-AR mRNA的表達(dá)無明顯變化，而2 h后，ET-AR mRNA表達(dá)開始增加，4 h達(dá)高峰(P<0.01)，8 h的時(shí)候較4 h組明顯降低，但仍高于對(duì)照組水平。 6．醛固酮?jiǎng)┝恳蕾囆哉T導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞ET-AR mRNA的表達(dá)及螺內(nèi)酯的抑制作用：與正常對(duì)照組相比，醛固酮(10<'-9>、10<'

10、-8>和10<'-7>mol/L)作用心臟成纖維細(xì)胞4 h，ET-AR mRNA表達(dá)明顯增加，且呈劑量依賴性(P<0.05、P<0.01和P<0.01)；以螺內(nèi)酯(10<'-6>mol/L)預(yù)處理心臟成纖維細(xì)胞2 h后，再加入醛固酮(10<'-7>mol/L)作用4 h后，ET-AR tuRNA表達(dá)與醛固酮(10<'-7>mol/L)組相比顯著降低，而與對(duì)照組相比無明顯差異；同時(shí)，單獨(dú)使用螺內(nèi)酯(10<'-6>mol/L)并不改變ET-

11、AR mRNA的表達(dá)。 結(jié)論：醛固酮?jiǎng)┝恳蕾囆陨险{(diào)心臟成纖維細(xì)胞的ET-1/ET-AR系統(tǒng)的表達(dá)，且此作用可能是通過MR受體介導(dǎo)的。 第二部分：醛固酮對(duì)心臟成纖維細(xì)胞 TGF-β1/TGF-βR Ⅰ系統(tǒng)表達(dá)的影響 目的：醛固酮對(duì)新生大鼠心臟成纖維細(xì)胞 TGF-β1/TGF-βR Ⅰ系統(tǒng)表達(dá)的影響及其可能的作用機(jī)制。 方法：應(yīng)用ELISA測(cè)定心臟成纖維細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)液中的TGF-β1，Westem blot檢

12、測(cè)心臟成纖維細(xì)胞 TGF-β1，半定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)心臟成纖維細(xì)胞TGF-β1和TGF-βR Ⅰ mRNA表達(dá)的變化。 結(jié)論：醛固酮?jiǎng)┝恳蕾囆陨险{(diào)心臟成纖維細(xì)胞的TGF-β1/TGFβRⅠ系統(tǒng)的表達(dá)，且此作用可能是通過MR受體介導(dǎo)的。 第三部分：阿托伐他汀和普伐他汀對(duì)醛固酮誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞ET-1/ET-AR系統(tǒng)表達(dá)的影響 目的：探討阿托伐他汀和普伐他汀對(duì)醛固酮誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞的ET-1/ET-AR

13、系統(tǒng)表達(dá)的影響及其可能的作用機(jī)制。 方法：采用放射免疫分析法測(cè)定心臟成纖維細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)液中的ET，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心臟成纖維細(xì)胞ET-1，半定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)心臟成纖維細(xì)胞ppET-1和ET-AR mRNA表達(dá)的變化。 結(jié)論：阿托伐他汀和普伐他汀劑量依賴性下調(diào)醛固酮誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞ET-1/ET-AR 系統(tǒng)的表達(dá)，其機(jī)制可能與甲羥戊酸代謝途徑有關(guān)。 第四部分：阿托伐他汀和普伐他汀對(duì)醛固酮誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞

14、TGF-β1/TGF-βR Ⅰ系統(tǒng)表達(dá)的影響 目的：探討阿托伐他汀和普伐他汀對(duì)醛固酮誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞的TGF-β1/TGF-βR Ⅰ系統(tǒng)表達(dá)的影響及其可能的作用機(jī)制。 方法：應(yīng)用ELISA測(cè)定心臟成纖維細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)液中的TGF-β1，Westem blot檢測(cè)心臟成纖維細(xì)胞 TGF-β1，半定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)心臟成纖維細(xì)胞TGF-β1和TGF-βR Ⅰ mRNA表達(dá)的變化。 結(jié)論：阿托伐他汀和普伐他汀劑

15、量依賴性下調(diào)醛固酮誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞 TGF-β1/TGF-βRⅠ系統(tǒng)的表達(dá)，其機(jī)制可能與甲羥戊酸代謝途徑有關(guān)。 第五部分：p44/42 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在心臟成纖維細(xì)胞 ET和TGF-β1分泌中的作用 目的：探討p44/42 MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在心臟成纖維細(xì)胞 ET 和ET和TGF-β1分泌中的作用。 方法：采用放射免疫分析法和ELISA分別測(cè)定心臟成纖維細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)液中的。ET和 ET和TGF-β1，

16、Western blot 技術(shù)檢測(cè)心臟成纖維細(xì)胞 p44/42MAPK和磷酸化p44/42 MAPK蛋白含量的變化。 結(jié)論：醛固酮能通過MR活化新生大鼠心臟成纖維細(xì)胞的p44/42 MAPK，誘導(dǎo)ET和TGF-β1表達(dá)；阿托伐他汀和普伐他汀可能通過甲羥戊酸代謝途徑下調(diào)醛固酮誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞p44/42 MAPK的活化水平，抑制醛固酮誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞ET和TGF-β1的分泌，從而減緩心肌纖維化。從分子水平探討了p44/42