子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞GJIC功能在EMs發(fā)病中的意義及ATRA調(diào)節(jié)EMs內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞GJIC功能的探討.pdf

1、子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)是婦科的常見病、多發(fā)病，約有10％～15％的育齡婦女罹患此病。EMs的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，現(xiàn)有的手術(shù)治療及藥物治療方案均難以達(dá)到滿意的效果。因此進(jìn)一步探討EMs的發(fā)病機(jī)制及尋求新的治療靶點尤為必要。 EMs具有類似腫瘤的粘附、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為，二者在發(fā)病機(jī)制上可能具有一定的相似性，而間隙連接細(xì)胞間通訊(GJIC)功能缺陷或低下是腫瘤的普遍特征，因此我們推測在EMs的發(fā)病過程中可能也存在GJIC功能的異

2、常。 GJIC是相鄰細(xì)胞間傳遞信息的主要方式，它在維持機(jī)體組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、調(diào)節(jié)正常細(xì)胞的生長等方面極為重要。細(xì)胞GJIC功能受其結(jié)構(gòu)單位連接子的調(diào)控，圓柱狀的連接子含有一個親水通道，它允許離子(Na+、K+、Ca2+等)及分子量小于1000的小分子(cAMP、cGMP、IP3等)自由通過。每個連接子由6個蛋白亞單位(Cx)組成，嚙齒動物和人的子宮內(nèi)膜中表達(dá)的連接蛋白主要有Cx43、Cx32、Cx26三種。 在EMs的發(fā)

3、病過程中，間質(zhì)細(xì)胞起著重要的主導(dǎo)作用，正常間質(zhì)細(xì)胞具有完善的GJIC功能，并且能通過問隙連接影響上皮細(xì)胞的GJIC功能狀態(tài)，故EMs內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的GJIC功能理應(yīng)受到更多的關(guān)注。 研究發(fā)現(xiàn)全反式維甲酸(ATRA)具有上調(diào)腫瘤細(xì)胞Cx表達(dá)和GJIC功能的作用，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞恢復(fù)良性表型。ATRA對正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞也有類似的上調(diào)作用，但尚不清楚ATRA是否能調(diào)節(jié)EMs內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞Cx表達(dá)及GJIC功能。探討這些問題將為ATRA

4、嘗試用于EMs的治療提供理論依據(jù)。 本研究分為三個部分：(1)建立EMs在位、異位和正常內(nèi)膜的間質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)模型：(2)通過體外培養(yǎng)的內(nèi)膜細(xì)胞分析EMs內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞Cx表達(dá)及GJIC功能的差異；采用反義寡聚核苷酸技術(shù)抑制正常內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞Cx的表達(dá)，了解GJIC功能抑制后，正常內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的生長、粘附及侵襲能力是否增強(qiáng)，以此全面分析間質(zhì)細(xì)胞的GJIC功能在EMs發(fā)病中的作用：(3)探討ATRA對EMs在位及異位內(nèi)膜間質(zhì)

5、細(xì)胞GJIC功能的調(diào)節(jié)作用及相關(guān)機(jī)制，以初步解答ATRA用于EMs治療的可能性。 第一部分 EMs在位、異位及正常內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)目的：探索一種獲得高產(chǎn)率及高純度子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，同時建立EMs在位、異位及正常內(nèi)膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)模型，并嘗試細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇，為后續(xù)實驗奠定基礎(chǔ)。 方法：選取重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科2006年2月～2007年1月住院行手術(shù)治療的內(nèi)異癥患者41例，

6、其中合并單側(cè)或雙側(cè)卵巢巧克力囊腫24例；取同期因子宮肌瘤行子宮全切術(shù)的患者30例作對照。刮取靠近子宮底部的內(nèi)膜組織或剝?nèi)÷殉睬煽肆δ夷[的內(nèi)壁。借鑒傳統(tǒng)的細(xì)胞分離方法并加以改良，采用機(jī)械碎化、多種酶聯(lián)合消化、細(xì)胞濾網(wǎng)分選、不同細(xì)胞貼壁時間差而將間質(zhì)與上皮細(xì)胞分離純化。結(jié)果：間質(zhì)細(xì)胞與上皮細(xì)胞同時成功培養(yǎng)率分別為：異位內(nèi)膜組33.3％(8/24)、EMs在位內(nèi)膜組92.7％(38/41)、對照組93.3％(28/30)，兩組在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞

7、純度達(dá)98％，異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞純度為95％；兩組在位內(nèi)膜上皮細(xì)胞純度達(dá)95％，異位內(nèi)膜上皮細(xì)胞純度為92％。上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞均能成功地凍存與復(fù)蘇。 結(jié)論：改良的分離方法可提高間質(zhì)細(xì)胞與上皮細(xì)胞的產(chǎn)率與活力，而且兩種細(xì)胞的純度較高，能完全滿足后續(xù)實驗的要求。 目的：找出EMs內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞Cx表達(dá)及GJIC功能的差異，探討間質(zhì)細(xì)胞GJIC功能異常在EMs發(fā)病過程中的意義。 方法：(1)以免疫熒光法檢測EMs異位、在位

8、內(nèi)膜以及正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞Cx43、Cx32、Cx26的表達(dá)。(2)采用熒光漂白后恢復(fù)技術(shù)分析三組內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞的GJIC功能，并探討共培養(yǎng)體系中EMs內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞對不同上皮細(xì)胞GJIC功能的調(diào)節(jié)作用。(3)通過Lipo介導(dǎo)下的反義寡聚核苷酸技術(shù)(ASODNs)，特異性下調(diào)正常間質(zhì)內(nèi)膜細(xì)胞中Cx43蛋白表達(dá)，分析間質(zhì)細(xì)胞的生長、粘附及侵襲能力的改變。結(jié)果：Cx43在對照組間質(zhì)細(xì)胞、EMs在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞、異位內(nèi)膜間質(zhì)

9、細(xì)胞中表達(dá)依次降低；Cx32、Cx26僅表達(dá)于兩組在位內(nèi)膜的上皮細(xì)胞中，且兩組間的表達(dá)量相同；異位內(nèi)膜上皮細(xì)胞出現(xiàn)Cx43的異常表達(dá)。對照組、EMs在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜三組的上皮細(xì)胞GJIC功能無明顯差異，其間質(zhì)細(xì)胞GJIC功能則按對照組→EMs在位組→EMs異位組依次減弱。EMs在位、異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞對不同上皮細(xì)胞GJIC的調(diào)節(jié)作用均較對照組減弱。間質(zhì)細(xì)胞的GJIC功能以及對上皮細(xì)胞的調(diào)節(jié)能力與其Cx43的表達(dá)量密切相關(guān)。ASODNs+

10、Lipo的轉(zhuǎn)染效率較高，對目的蛋白Cx43的抑制作用明顯，撤除ASODNs+Lipo后，抑制效果至少可持續(xù)48h以上。GJIC功能被抑制后，正常間質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出生長加速，粘附、侵襲能力增強(qiáng)。 結(jié)論：間質(zhì)細(xì)胞Cx43表達(dá)降低、GJIC功能減弱與EMs發(fā)病關(guān)系密切，間質(zhì)細(xì)胞的Cx43或GJIC功能可能是EMs潛在的治療靶點。 方法：(1)采用不同濃度的ATRA處理EMs在位及異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞，并檢測其GJIC功能及Cx43 m

11、RNA和蛋白的表達(dá)。(2)引入雌激素受體(ER)拮抗劑ICI 182 780，分析ATRA的作用與ER的關(guān)系。(3)引入TPA(佛波酯，系Cx磷酸化誘導(dǎo)劑)，分析ATRA的作用與Cx43蛋白磷酸化狀態(tài)的關(guān)系。 結(jié)果：ATRA濃度為1μmol/L和10μmol/L時，均能有效上調(diào)EMs內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的GJIC功能，但上調(diào)作用至72h以后不再繼續(xù)增加；ATRA濃度為0.1μmol/L時則沒有上調(diào)作用。1μmol/L ATRA能誘導(dǎo)間質(zhì)