Isoform-specific regulation of Na-K pump and its mechanism by adrenergic agonists in rat cardiocytes.pdf

1、Na/K泵(Na/K pump,NKP)是普遍存在于細(xì)胞膜上的一種酶,它屬于P型ATP酶家族。Na/K泵可以逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)3個(gè)鈉離子和2個(gè)鉀離子,同時(shí)消耗1分子的ATP。此外,它還可以作為轉(zhuǎn)運(yùn)其他溶質(zhì)、氨基酸、鹽類和磷酸鹽等的驅(qū)動(dòng)力。這種非等值的轉(zhuǎn)運(yùn)是一個(gè)生電的過程,并且產(chǎn)生一個(gè)跨膜的電位進(jìn)而引起細(xì)胞的興奮。在許多臨床疾病的發(fā)生過程中都伴隨著Na/K泵的活性的改變,例如高血壓,糖尿病和其他疾病。因此,Na/K泵活性調(diào)節(jié)機(jī)制的闡明變得至關(guān)

2、重要。
　　 腎上腺素受體可以調(diào)節(jié)Na/K泵活性,其分為兩種亞型,即α-和β-腎上腺素受體,二者均可調(diào)節(jié)Na/K泵的活性,并且這種調(diào)節(jié)包括短時(shí)程作用和長時(shí)程作用,但其分子機(jī)制仍不清楚。Na/K泵短時(shí)程和長時(shí)程調(diào)節(jié)機(jī)制的闡明對分析細(xì)胞、組織對激素的適應(yīng)性以及生物體電解質(zhì)的狀況都是必需的,同時(shí),對由于Na/K泵功能紊亂所致疾病的治療也是至關(guān)重要的。本實(shí)驗(yàn)主要探討了腎上腺素受體的短時(shí)程和長時(shí)程激活對Na/K泵活性的影響及其相關(guān)機(jī)制。<

3、br>　　 目的:眾多因素對Na/K泵的調(diào)節(jié)可分為短時(shí)程和長時(shí)程調(diào)節(jié),本研究旨在探討腎上腺素受體激活對大鼠心肌細(xì)胞Na/K泵的調(diào)節(jié)及其機(jī)制。
　　 方法:(1)心肌細(xì)胞的急性分離:酶解法急性分離SD大鼠心肌細(xì)胞,并保存在KB溶液中。然后,分別短時(shí)程(10min)和長時(shí)程(24h)室溫下孵育去甲腎上腺素(NA)(共孵育普萘洛爾,以阻斷β-腎上腺素受體)和異丙腎上腺素(ISO)。
　　 (2)Na/K泵電流的測定:應(yīng)用全細(xì)

4、胞膜片鉗技術(shù)觀察細(xì)胞膜電流以檢測α-和β-腎上腺素受體激動(dòng)劑對Na/K泵電流(Ip)的影響。
　　 (3)全細(xì)胞蛋白、質(zhì)膜蛋白和內(nèi)體的提取:用藥品孵育急性分離的心肌細(xì)胞,然后用冷的裂解液裂解以獲得全細(xì)胞蛋白。按照細(xì)胞表面蛋白分離試劑盒(Thermo)的說明提取細(xì)胞質(zhì)膜蛋白。應(yīng)用蔗糖梯度的方法提取早期內(nèi)體(EE)和晚期內(nèi)體(LE)。BCA蛋白試劑盒測定蛋白濃度。
　　 (4)蛋白免疫印跡:用10％的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電

5、泳分離等量的蛋白后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,然后用TBST溶解的5％脫脂奶粉37℃下封閉1小時(shí)。一抗是Na/K泵α1亞基抗體(Santa,1:500)和α2亞基抗體(Upstate,1:200)。辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠和抗兔抗體(KPL,1:1000)作為二抗。用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光的方法對印跡條帶進(jìn)行曝光。
　　 (5)mRNA的提取:依照Promege SV總RNA分離系統(tǒng)試劑盒的說明從大鼠心肌細(xì)胞上提取總RNA。
　　 (

6、6)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR):應(yīng)用Na/K泵α1和α2亞基的特異性引物,通過PCR技術(shù)擴(kuò)增反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA)。PCR產(chǎn)物用2％的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離,并用GoldViewⅡ進(jìn)行核酸染色。
　　 (7)實(shí)時(shí)定量PCR對特異cDNA的定量:選擇GAPDH作為管家基因。對Na/K泵α1和β2亞基以及GAPDH同時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。PCR產(chǎn)物用2％的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果:
　　 (1)短

7、時(shí)程激活腎上腺素受體可以以亞基特異性的方式影響Na/K泵電流(Ip)。α-腎上腺素受體(α-AR)的激活通過與Na/K泵α2亞基相偶聯(lián)升高高親和力泵電流(Ih),不影響由Na/K泵α1亞基引起的低親和力泵電流(I1);β-腎上腺素受體(β-AR)的激活通過與Na/K泵α1亞基相偶聯(lián)降低I1,對由α2亞基引起的Ih沒有影響。
　　 (2)無論是α-還是β-腎上腺素受體,短時(shí)程激活均不影響Na/K泵α亞基的mRNA水平和全細(xì)胞蛋白含

8、量。
　　 (3)α-腎上腺素受體短時(shí)程激活可增加細(xì)胞質(zhì)膜上Na/K泵α2亞基蛋白含量,不影響α1亞基蛋白含量;而β-腎上腺素受體短時(shí)程激活可降低質(zhì)膜上Na/K泵α1亞基蛋白含量,不影響α2亞基蛋白含量。
　　 (4)α-和β-腎上腺素受體短時(shí)程激活對Na/K泵的作用可被能阻止質(zhì)膜上Na/K泵α亞基轉(zhuǎn)位的鬼筆環(huán)肽取消。
　　 (5)α-腎上腺素受體短時(shí)程激活通過PKC通路對Na/K泵活性進(jìn)行調(diào)節(jié),β-腎上腺素受體

9、短時(shí)程激活通過PKA通路對Na/K泵活性進(jìn)行調(diào)節(jié)。
　　 (6)腎上腺素受體長時(shí)程激活對Na/K泵電流密度的調(diào)節(jié)亦是以亞基特異性的方式進(jìn)行的。α-腎上腺素受體的長時(shí)程激活通過與Na/K泵α2亞基相偶聯(lián)降低Ih密度,不影響由Na/K泵伍α1亞基引起的I1密度;β-腎上腺素受體的激活通過與Na/K泵α1亞基相偶聯(lián)升高I1密度,對由α2亞基引起的Ih密度沒有影響。
　　 (7)α-腎上腺素受體長時(shí)程激活可以減少Na/K泵α2亞

10、基的蛋白表達(dá),不影響α1亞基;β-腎上腺素受體長時(shí)程激活可以增加Na/K泵α1亞基的蛋白表達(dá),不影響α2亞基。
　　 (8)α-腎上腺素受體長時(shí)程激活可以降低Na/K泵α2亞基的mRNA水平,不影響α1亞基;β-腎上腺素受體長時(shí)程激活可以升高Na/K泵α1亞基的mRNA水平,不影響α2亞基。
　　 (9)α-腎上腺素受體長時(shí)程激活通過PKC通路對Na/K泵活性進(jìn)行調(diào)節(jié),β-腎上腺素受體長時(shí)程激活通過PKA通路對Na/K泵

11、活性進(jìn)行調(diào)節(jié)。
　　 結(jié)論:無論短時(shí)程或長時(shí)程激活α-AR和β-AR,均可亞基特異性調(diào)節(jié)大鼠心肌細(xì)胞Na/K泵活性,其中α-AR激活與Na/K泵α2亞基偶聯(lián),經(jīng)PKC通路調(diào)節(jié)高親和力Na/K泵活性,β-AR激活與Na/K泵α1亞基偶聯(lián),經(jīng)PKA通路調(diào)節(jié)低親和力Na/K泵活性;無論α-AR或β-AR,長時(shí)程激活對Na/K泵活性的影響均與短時(shí)程激活時(shí)相反,且短時(shí)程激活時(shí)均與其相應(yīng)α-亞基在細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)位有關(guān),而長時(shí)程激活時(shí)均與其相應(yīng)