心衰大鼠心肌Na+-K+泵電流及其相應(yīng)α亞基的改變.pdf

1、心力衰竭(heart failure,HF)是全世界流行的一種心血管疾病,其發(fā)病具有復(fù)雜性和多因素性,其中室性心率失常和心肌收縮減弱是引發(fā)心衰的主要原因,而細(xì)胞內(nèi)Ca2+調(diào)節(jié)的改變則是心臟收縮障礙和心律失常發(fā)生的共同通路。
　　 無論最初何種起因(高血壓,心肌缺血,心肌病等),一旦心肌受到損傷,結(jié)果都會(huì)導(dǎo)致心力衰竭。最初階段,可以通過激活交感神經(jīng)和腎素-血管緊張素系統(tǒng),對(duì)初始心肌損害造成的心肌收縮功能減弱進(jìn)行代償,并逐漸導(dǎo)致左心

2、室擴(kuò)大和/或肥厚。但久而久之,若心臟功能持續(xù)減弱,并伴隨神經(jīng)內(nèi)分泌的過度激活,那么心臟的損傷就會(huì)累積和不可逆,而且不能滿足機(jī)體的代謝需要,導(dǎo)致心衰[2]。
　　 在過去50年里,有以下機(jī)制解釋心臟的功能異常:(1)能量產(chǎn)生和利用的損傷(2)前負(fù)荷和后負(fù)荷的增加(3)神經(jīng)激素和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的改變(4)細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載和Ca2+調(diào)節(jié)的異常。由于心衰常常伴有心臟形狀和體積的改變,這提示心肌損傷可能導(dǎo)致心肌改型。壓力超負(fù)荷和容量過度負(fù)荷造

3、成的心衰是心肌改型的結(jié)果[3]。
　　 在心肌肥厚和心衰期間,細(xì)胞內(nèi)Na+增加可以通過Na+/Ca2+交換體增加Ca2+內(nèi)流,從而有助于增加收縮力或者維持收縮力。在心衰這種病理生理學(xué)狀態(tài)下,一些Na+轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)和功能受到影響,都可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Na+增加。如有文獻(xiàn)報(bào)道Na+-K+泵的活性下降和Na/H+交換體的表達(dá)上調(diào)都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Na+增加[4]。
　　 Na+K+泵通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Na+來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度[5]。

4、Na+/Ca2+交換體與Na+-K+泵是緊密相連的,抑制Na+-K+泵后可通過Na+/Ca2+交換體來增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+,從而加強(qiáng)心肌收縮力[6-9]。所以Na+K+泵活性的改變對(duì)于心肌收縮力影響十分重要[10,11]。Na+-K+泵系由α亞基(～110 kDa)和β亞基(～55 kDa)組成的異源二聚體。Α亞基調(diào)節(jié)酶的催化活性以及包括和Na+,K+,ATP以及強(qiáng)心苷的結(jié)合位點(diǎn)[12-14]。Α亞基有四種不同的亞型(α1,α2,α3,α

5、4),其分布具有組織特異性和種屬差異[15]。Α1和α2主要分布在大鼠、豚鼠和小鼠的心臟,α1、α2和α3主要分布在人的心臟[16,17]。
　　 人心衰后,心肌細(xì)胞Na+-K+泵的伍α1、α3和β1的表達(dá)均有顯著性下降,而α2沒有改變,Na+-K+泵的活性下降[18]。在心衰家兔的心肌細(xì)胞上,Na+-K+泵的活性沒有改變[19]。免疫印跡結(jié)果表明,心衰大鼠α1和α2的表達(dá)較正常大鼠分別下降了～19％和～74％;而Svein等報(bào)

6、道,心衰大鼠的α1和β1亞基在mRNA和蛋白表達(dá)水平均無顯著改變,僅α2亞基在mRNA和蛋白表達(dá)水平分別下降了25％和55％[20,21]。
　　 鑒于文獻(xiàn)關(guān)于心衰后Na+-K+泵的活性及其亞基改變的報(bào)道并不一致,本實(shí)驗(yàn)擬在來自阿霉素致大鼠心衰模型的心肌細(xì)胞,以全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)測(cè)定Na+-K+泵電流(Ip)和分子生物學(xué)技術(shù)測(cè)定Na+-K+泵α亞基表達(dá),旨在研究心衰大鼠Na/K泵活性的改變和相應(yīng)亞基的改變,并分析Na+-K+泵在心

7、衰發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　 目的:檢測(cè)心衰大鼠Na+-K+泵活性的變化,以及Na+-K+泵α亞基的在蛋白水平的改變。
　　 方法:(1)采用阿霉素(ADR)致大鼠心衰的方法建立大鼠心衰模型:雄性SD大鼠,體重200-250g,由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將36只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(NOR)和心衰組(HF)。心衰組第2、4天腹腔注射ADR1mg/kg,第6、8天注射ADR2mg/kg,第10、12天注射ADR3mg

8、/kg,第14、16天注射ADR3mg/kg。對(duì)照組每次腹腔注射等容積的生理鹽水。17-20天后,通過行為體征觀察,體重(BW)、肺重比體重(LW/BW)、左心室重比體重(LVW/BW)及心功能如心率(HR)、左心室收縮壓(INSP)、左心室舒張末期壓(INEDP)、左室壓力最大上升速度(+dp/dtmax)、左室壓力最大下降速度(-dp/dtmax)的測(cè)定進(jìn)行心衰評(píng)價(jià)。
　　 (2)酶解法急性分離大鼠心室肌細(xì)胞:取實(shí)驗(yàn)用SD大

9、鼠,腹腔注射肝素2500U·kg-1和12mg·L-1的戊巴比妥鈉50mg·kg-1,待動(dòng)物麻醉后,使用Langendorff裝置,行主動(dòng)脈插管逆行灌流(溫度,壓力恒定),先灌流無Ca2+臺(tái)式液約10ml,再灌流含膠原酶Ⅱ(0.6mg·ml-1)及CaCl2(30μM·L-1)的臺(tái)式液30ml消化心臟,反復(fù)循環(huán)灌流20-25min,急性分離大鼠心室肌細(xì)胞。
　　 (3)Na+-K+泵電流測(cè)定:以全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)(whole-ce

10、ll patch-clamptechnique)記錄Na+-K+泵電流(Ip),Na+-K+泵一次主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)可將3個(gè)Na+泵出細(xì)胞外,同時(shí)泵進(jìn)2個(gè)K+,因而可產(chǎn)生一個(gè)純凈的向外電流。在特定的細(xì)胞外液和電極內(nèi)液阻斷細(xì)胞膜上其他離子通道和交換體電流的條件下(主要是K電流,Ca電流,Na+/Ca2+交換體電流),灌流Na+-K+泵的抑制劑哇巴因(OUA),使膜電流產(chǎn)生內(nèi)向移動(dòng),此差別電流反應(yīng)Ip大小。1mmol·L-1的哇巴因可以完全阻斷Na+

11、-K+泵,產(chǎn)生的電流即Ip。電流密度即是電流大小與電容之比。以哇巴因濃度([OUA])對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo),以哇巴因?qū)a+-K+泵電流抑制的百分率(△Ip)為縱坐標(biāo),繪制△Ip-[OVA]量效關(guān)系曲線,并采用兩點(diǎn)結(jié)合模型公式進(jìn)行曲線擬合。
　　 (4)采用Western Blot方法測(cè)定Na+-K+泵α1和α2亞基蛋白表達(dá)的變化:提取NOR和HF組大鼠心室肌細(xì)胞膜蛋白,用BCA蛋白定量法進(jìn)行蛋白定量,10％SDS-聚丙烯酰胺電泳,轉(zhuǎn)

12、膜,5％脫脂奶粉振蕩封閉1小時(shí),加α亞基特異性的抗體,4℃孵育過夜,TBST洗三次,加二抗37℃孵育1小時(shí),TBS洗三次,DAB顯色。
　　 結(jié)果:(1)心衰模型相關(guān)指標(biāo)評(píng)價(jià):HF組大鼠10天后出現(xiàn)中毒現(xiàn)象,表現(xiàn)為精神狀態(tài)差,BW、HR、LVSP以及+dp/dtmax、-dp/dtmax都明顯下降(p＜0.05),而LVW/BW、LW/BW、LVEDP有顯著升高(p＜0.05)。給藥前正常組BW、LVW/BW、LW/BW、HR、

13、LVSP、LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax分別為2384±15g、2.14±0.11mg·g-1、4.11±0.27 mg·g-1、483±23次/min,129±4mmHg、5.9±0.9mmHg,3357±101mmHg/s,3314±127mmHg/s。給藥后心衰組BW、LVW/BW、LW/BW、HR、LVSP、LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax分別為207±13g、2.61±0.04mg·g-1

14、、5.51±0.31mg·g-1,388±34次/min、80±4mmHg、11.3±1.2mmHg、1727±55mmHg/s、1550±45mmHg/s。
　　 (2)心衰大鼠Ip的改變:與正常大鼠Na+-K+泵電流密度相比,心衰大鼠Na+-K+泵電流密度顯著下降(0.5070+0.06297pA/pF vs0.2106+0.04890 pA/pF,p＜0.05)。繪制Aip-[OUA]量效關(guān)系曲線,對(duì)Aip-[OUA]量效

15、關(guān)系曲線以兩個(gè)以上α亞基兩位點(diǎn)公式進(jìn)行擬合,結(jié)果表明正常和心衰大鼠均存在高低親和力兩種Na+-K+泵。不同的是,正常大鼠低親和力鈉泵K值為2.85x10-5M,高親和力鈉泵K值為6.74x10-8M,阿霉素致大鼠心衰后,其低親和力鈉泵K值為3.55x10-5M,而高親和力鈉泵K值為2.97×10-7M。由以上結(jié)果可知,大鼠心衰后高親和力鈉泵發(fā)生了變化。
　　 (3)心衰大鼠Na+-K+泵α1和α2亞基蛋白表達(dá)的變化:我們使用We

16、stern blot檢測(cè)技術(shù)在正常及心衰大鼠的心肌均檢測(cè)到α1和α2亞基蛋白(112 KD)。與正常組相比,心衰組Na+-K+泵低親和力α1亞基蛋白表達(dá)無明顯改變,而高親和力α2亞基蛋白表達(dá)則明顯下降,約下降了50％(p＜0.05)。這進(jìn)一步提示阿霉素致大鼠心衰的機(jī)制是Na+-K+泵的α2亞基發(fā)生改變,與電生理結(jié)果一致。
　　 結(jié)論:大鼠心衰后電流密度顯著下降。Aip-[OUA]量效關(guān)系曲線表明心衰大鼠Na+-K+泵的高親和力泵