MG53上調正常和缺氧復氧損傷的新生大鼠心肌細胞瞬間外向K+電流.pdf

1、Mitsugmin53(MG53),是一種肌特異性的RBCC/TRIM家族成員,又稱為TRIM72蛋白。RBCC/TRIM家族蛋白的氨基端有三個高度保守的序列組成,分別是環(huán)指結構,鋅指結構(B-box)和螺旋結構,在它的羧基端包含著PRY、SPRY等結構域,與人類的很多疾病的形成有關,可能參與到癌癥形成,病毒感染等病理過程中。MG53蛋白特異性的在骨骼肌和心肌細胞中表達,主要以小囊泡的形式存在。大量研究表明MG53與細胞膜的損傷修復密切

2、相關,一旦細胞膜發(fā)生損傷,MG53就會聯(lián)合caveolin-3(小窩蛋白3),通過感知細胞內的氧化環(huán)境的變化,促進帶有MG53的小囊泡向受損的部位募集并從細胞膜出芽,從而以膜片的方式進行修復。有研究報道,在心肌缺血再灌注損傷過程中,MG53能通過介導損傷細胞膜修復作用來對心肌起一個保護作用,同時在心肌缺血預適應這樣一個保護心肌過程中,MG53也是一個重要的參與組成部分。心肌細胞膜瞬間外向鉀通道(transient outward cha

3、nnel,Ito)是一種電壓依賴性的鉀通道,膜電位去極化時激活,具有快速激活和快速失活的特性,是構成動作電位(actionpotential,AP)復極化1期的主要鉀電流,同時也是嚙齒類動物復極化的主要鉀電流,其改變對AP時程有重要影響,是疾病條件下引起心律失常的重要因為。本研究通過模擬臨床上的缺血再灌注,建立缺氧復氧損傷的細胞水平模型,來探討MG53對Ito電流及其對心電穩(wěn)定性的影響,探索在心肌缺血再灌注過程中,MG53是否能通過介導

4、對損傷心肌細胞膜上的離子通道重構的修復,而起到心臟保護作用。為臨床上缺血再灌注等疾病的治療提供一個新的靶點。
　　 第一章正常條件下過表達MG53對大鼠心肌細胞膜上瞬間外向鉀通道(Ito)功能的調節(jié)
　　 本實驗利用腺病毒載體技術,將帶有MG53基因的重組腺病毒載體轉染進乳鼠心肌細胞,使乳鼠心肌細胞過表達MG53,從而觀察MG53對Lto功能的調控,并探討正常生理條件下MG53對心肌細胞上Ito的功能和電生理機制的調節(jié)作

5、用。結果表明:
　　 1.MG53對瞬間外向鉀通道(Ito)功能的調節(jié)
　　 1.1.MG53對瞬間外向鉀通道(Ito)電流密度和門控動力學的影響
　　 乳鼠心肌細胞轉染兩種腺病毒,分別為AdMG53和AdGFP(作為對照),48h后膜片鉗記錄Ito電流。結果表明,較AdGFP組相比,AdMG53組Ito電流密度顯著增加,增加了1.9倍(P=0.000<0.05)。即MG53能顯著增加Ito電流密度,但對Ito通

6、道的激活動力學無顯著影響。AdMG53組在+60mV所產生電流達到峰值的時間(time to peak,TTP)較AdGFP組延長,但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.168>0.05)。同時,MG53能顯著減慢Ito通道的失活動力學,使Ito通道電流衰減的時間延長。AdMG53組電流峰值衰減一半的時間T0.5較AdGFP組顯著延長(P=0.015<0.05),有統(tǒng)計學意義。
　　 1.2.MG53對瞬間外向鉀通道(Ito)電壓依賴性激

7、活的影響
　　 AdMG53組電流密度在+10～+90 mV的電壓范圍內均顯著高于AdGFP組P<0.05。AdGFP組與AdMG53組電壓依賴性激活曲線無明顯變化,V0.5,act分別為52.85±3.03 mV(n=14)和45.00±3.80 mV(n=10),P=0.116>0.05,k值兩組之間無統(tǒng)計學意義,說明MG53不改變Ito的離子選擇性,MG53對鉀電流激活曲線無明顯影響。
　　 1.3.MG53對瞬間

8、外向鉀通道(Ito)電壓依賴性失活的影響
　　 與AdGFP組比,AdMG53組的電壓依賴性失活曲線發(fā)生正向移位,AdGFP組和AdMG53組的V0.5,inact值分別為-23.65±3.35mV(n=9)和-15.13±2.17mV(n=11),t=2.208,P=0.040<0.05,有統(tǒng)計學意義。k值兩組之間差異也無統(tǒng)計學意義。
　　 2.MG53對瞬間外向鉀通道(Ito)蛋白表達的影響
　　 Ito由α

9、亞基(主要為Kv4.2)和β亞基(主要為KChIP2)構成。本研究同時觀察了過表達MG53對乳鼠心肌細胞以下2組蛋白表達量的影響:KChIP2和Kv4.2。結果表明,MG53能使乳鼠心肌細胞上的Ito的β亞基KChIP2蛋白的表達量顯著增加,增加了3-4倍,有統(tǒng)計學意義(P=0.015<0.05)。但對Ito的α亞基Kv4.2蛋白的表達量無顯著影響,差異無統(tǒng)計學意義(P=0.434>0.05)。結果表明,MG53上調Ito的一個重要機制

10、是增加其β亞基KChIP2的表達量。
　　 結論:
　　 1.MG53能夠增加瞬間外向鉀通道(Ito)電流密度,減慢通道的失活動力學,但對Ito的激活動力學,以及電壓依賴性激活無顯著影響。MG53同時能夠使Ito的電壓依賴性失活曲線發(fā)生顯著正向移位,但不改變Ito的離子選擇性。
　　 2.MG53顯著增加KChIP2的表達量,但對Kv4.2蛋白的表達量無顯著影響,提示MG53上調Ito的一個重要機制是增加Ito的

11、β亞基的表達。
　　 第二章缺氧復氧(H/R)損傷對新生大鼠心肌細胞膜上瞬間外向鉀通道(Ito)功能的影響
　　 大量研究報道發(fā)現缺血,缺氧可以使心肌細胞膜上的瞬間外向鉀通道(Ito)受到抑制,本實驗通過模擬臨床的缺血再灌注損傷,在乳鼠心肌細胞上建立有效的缺氧復氧模型,根據相關文獻報道以及預實驗結果,建立缺氧4h復氧4h的缺氧復氧(H/R)模型,通過記錄Ito電流,來檢測模型是否成功,并進一步從分子水平來探索Ito各亞基

12、的表達水平變化。
　　 1.缺氧復氧(H/R)對瞬間外向鉀通道(Ito)功能的調節(jié)
　　 1.1.缺氧復氧(H/R)對瞬間外向鉀通道(Ito)電流密度和門控動力學的影響
　　 乳鼠心肌細胞于37℃,5％CO2培養(yǎng)24h后將培養(yǎng)基更換為缺氧液,放置低氧培養(yǎng)箱(37℃,1％O2,25％CO2)培養(yǎng)4h,再更換為復氧液,放置于37℃,5％CO2培養(yǎng)4h后膜片鉗記錄Ito電流。結果顯示,缺氧復氧(H4/R4)組Ito電流

13、密度低于正常(Normal)組,但差異無顯著性。H4/R4組的 TTP較正常組比時間延長約3.11 ms,但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.185>0.05)。同時,H4/R4組T0.5較正常組比時間延長約19.28 ms,但差異無顯著性(P=0.256>0.05)。而兩組細胞大小的差異有顯著性,H4/R4能使乳鼠心肌細胞電容(capacitance)顯著增加(P=0.000)。
　　 1.2.缺氧復氧(H/R)對瞬間外向鉀通道(It

14、o)電壓依賴性激活的影響
　　 H4/R4組電流密度在+20～+90 mV的電壓范圍內均顯著低于Normal組,P<0.05。為觀察H/R對Ito通道電壓依賴性激活動力學特征的影響,將Ⅰ-Ⅴ曲線的結果轉換成膜電導,對條件刺激電壓作圖,然后采用Boltzmarm方程g/gmax=1/{1+exp(V0.5-V)/k}進行擬合,式中得到Ito激活曲線,然后求得V0.5,act(半數激活電壓)和k(斜率因子)。H4/R4組與Norma

15、l組的V0.5,act無顯著差異(P=0.938>0.05),同時k值兩組之間也無統(tǒng)計學意義,說明H/R不改變的Ito通道的離子選擇,H/R對Ito電壓激活曲線無明顯影響。
　　 1.3.缺氧復氧(H/R)對瞬間外向鉀通道(Ito)電壓依賴性失活的影響
　　 H/R使Ito通道的電壓依賴失活曲線略負向移位,但無統(tǒng)計學意義。H4/R4組和Normal組的半數失活電壓V0.5,inact值分別為-29.15±3.28mV(n

16、=7),-23.65±3.35mV(n=9),t=1.152,P=0.269>0.05,無統(tǒng)計學差異。同時兩組之間的K值也無統(tǒng)計學差異。
　　 2.缺氧復氧(H/R)對乳鼠心肌細胞本身MG53蛋白表達的影響
　　 將培養(yǎng)24h的心肌細胞缺氧4h再復氧4h損傷后,提取細胞蛋白,根據BCA法蛋白定量結果,行 Western Blot檢測,H4/R4組較Normal組相比MG53蛋白表達量沒有變化,無統(tǒng)計學差異,P=0.085

17、>0.05。結果表明,缺氧復氧(H/R)對心肌細胞本身的MG53的蛋白表達并沒有影響。
　　 3.缺氧復氧(H/R)對瞬間外向鉀通道(Ito)的主要α亞基和β亞基的基因水平表達
　　 Ito由α亞基(主要為Kv4.2)和β亞基(主要為KChIP2)構成。結果表明H4/R4能減少Kv4.2和KChIP2的mRNA水平表達量,H4/R4組較Normal組Kv4.2和KChIP2的mRNA水平表達量均發(fā)生顯著減少,分別減少了8

18、1％,(P=0.000<0.05)和90％(P=0.002<0.05)。
　　 結論:缺氧4h后再復氧4h心肌細胞本身表達的MG53未發(fā)生改變,而抑制了瞬間外向鉀電流(Ito)。H/R能使的Ito電流密度減少。同時TTP和T0.5均延長,即減慢了Ito的激活和失活動力學,但差異無統(tǒng)計學意義。此外,H/R對Ito通道電壓依賴性激活和失活曲線無顯著改變,但能使Ito的主要α亞基Kv4.2和主要p亞基KChIP2的mRNA水平表達下降

19、。
　　 第三章缺氧復氧損傷下MG53對大鼠心肌細胞膜上瞬間外向鉀通道(Ito)重構的調節(jié)作用
　　 根據之前的結論,缺氧復氧(H/R)對心肌細胞本身的MG53表達沒有影響,且缺氧復氧(H/R)改變了瞬間外向鉀通道(Ito)的電生理特性和其亞基的mRNA水平表達量,缺氧復氧過程中,Ito發(fā)生重構。在正常情況下過表達MG53又能上調Ito,由此本實驗通過在乳鼠心肌細胞中過表達MG53,在缺氧復氧損傷條件下探索MG53在離子

20、通道重構中發(fā)生的作用。
　　 1.MG53對缺氧復氧條件下?lián)p傷心肌細胞的瞬間外向鉀通道(Ito)的主要α亞基和β亞基基因水平的影響
　　 Kv4.2和KChIP2分別是Ito通道的主要α亞基和β亞基,乳鼠心肌細胞轉染腺病毒48h后進行缺氧復氧(H/R)處理,提取樣本進行Realtime-PCR檢測Kv4.2和KChIP2的基因水平表達進行相對定量(即RQ值)。結果顯示H4/R4M組與H4/R4G組比較,Kv4.2基因的表

21、達水平未發(fā)生改變,無統(tǒng)計學差異,P=0.577>0.05。而H4/R4M組的KChIP2基因水平的表達量高于H4/R4G組,但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.349>0.05)。
　　 2.MG53對缺氧復氧條件下?lián)p傷心肌細胞的瞬間外向鉀通道(Ito)的主要α亞基和β亞基蛋白水平的影響
　　 MG53對H/R處理過的乳鼠心肌細胞的Ito的α亞基即Kv4.2的蛋白表達量沒有影響(P=0.691>0.05)。但能使β亞基KChIP

22、2蛋白表達量組顯著增加,增加了3-4倍,有統(tǒng)計學意義(P=0.005<0.05)。
　　 3.MG53對缺氧復氧條件下?lián)p傷的心肌細胞的瞬間外向鉀通道(Ito)功能的調控
　　 3.1.MG53對缺氧復氧條件下?lián)p傷的心肌細胞的瞬間外向鉀通道(Ito)電流密度和門控動力學的影響
　　 在缺氧復氧(H/R)損傷條件下,MG53能Ito電流密度增加,有統(tǒng)計學意義(P=0.001<0.05)。同時在H/R損傷下MG53對I

23、to通道的激活動力學和失活動力學無顯著影響。H4/R4M組在+60mV所產生電流達到峰值時間(time to peak,TTP)較H4/R4G組比無顯著差異,P=0.246>0.05。H4/R4M組電流峰值衰減一半的時間T0.5較H4/R4G組比沒有顯著差異,P=0.942>0.05,無統(tǒng)計學意義。兩組細胞電容大小的無顯著性差異,P=0.089>0.05。
　　 3.2.MG53對缺氧復氧條件下?lián)p傷的心肌細胞的瞬間外向鉀通道(I

24、to)電壓依賴性激活的影響
　　 細胞鉗制在-80mV,給予250ms,從-40 mV開始以10mV遞增到+90mV的電壓刺激以激活Ito。H4/R4M組電流密度在0mV～+90 mV的電壓范圍內均顯著高于H4/R4G組P<0.05。在此基礎上,根據Ⅰ—Ⅴ曲線計算出標準化激活穩(wěn)態(tài)(gm)的曲線,運用Boltzmann公式:G/Gmax=1/{1+exp[-(V-V0.5)/k]}擬合得到激活曲線,其中G/Gmax:通道電導百分數

25、,V:膜電位,V0.5,act半數最大激活電壓,k:斜率因子。結果表明H4/R4G組和H4/R4M組之間V0.5,act無顯著性差異(P=0.877>0.05),K值兩組之間也無顯著差異,說明缺氧復氧(H/R)損傷條件下MG53不改變的Ito通道的離子選擇,且對Ito電壓依賴性激活曲線無顯著影響。
　　 3.3.MG53對缺氧復氧條件下?lián)p傷的心肌細胞的瞬間外向鉀通道(Ito)電壓依賴性失活的影響
　　 結果表明,H4/R

26、4M組較H4/R4G組比,Ito電壓依賴性失活曲線發(fā)生正向移位,V0.5,inact值分別為-19.70±2.14mV(n=14),-29.15±3.28mV(n=7),t=2.488,P=0.022<0.05,有統(tǒng)計學差異。兩組的K值無統(tǒng)計學差異。
　　 結論:在缺氧復氧損傷條件下,過表達MG53能使缺氧復氧過程中被抑制的Ito上調。在Ito的主要α亞基和β亞基的蛋白表達水平上,過表達MG53使KChIP2蛋白表達增加,而對K