血管緊張素Ⅱ?qū)﹄嗍笮氖壹a，K-ATPase的調(diào)控.pdf

1、Na-K-ATPase作為一種重要的膜蛋白幾乎存在于所有的真核細(xì)胞膜上，它主要有α，β及γ亞基構(gòu)成寡聚體，其中α亞基是催化亞基，影響Na-K-ATPase的主要功能，迄今為止已有α1，α2，α3和α4四種α亞基被發(fā)現(xiàn)。Na-K-ATPase在心肌細(xì)胞上有廣泛分布，它在維持正常靜息電位和調(diào)節(jié)心臟興奮性方面發(fā)揮著重要作用。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)對(duì)其它組織諸如血管平滑肌細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞、乳房癌細(xì)胞中的Na-K-ATPase活性以及亞基與信號(hào)

2、傳導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)前人已做了一些研究，如Douglas等發(fā)現(xiàn)血管緊張素Ⅱ在大鼠近端小管短時(shí)作用(2分鐘)能夠增加鈉泵的活性，并且改變其磷酸化程度以及Na-K-ATPase的構(gòu)象[2]。Marsigliante等發(fā)現(xiàn)在大鼠甲狀腺細(xì)胞PC-C13中，血管緊張素Ⅱ?qū)ζ?0分鐘孵育作用能夠通過(guò)AT1受體及非典型的PKC-z活化上調(diào)鈉泵的活性[5]。但也有血管緊張素Ⅱ抑制Na-K-ATPase的活性的報(bào)道，如Marsigliante等發(fā)現(xiàn)在鰻魚(yú)的腸上

3、皮細(xì)胞中，0.01nM-100nM血管緊張素Ⅱ短時(shí)(5-15分鐘)孵育作用后對(duì)Na-K-ATPase活性呈現(xiàn)劑量關(guān)系性抑制作用，且這一作用是通過(guò)AT1受體實(shí)現(xiàn)[7]，這與前面所提及的血管緊張素Ⅱ升高Na-K-ATPase活性的報(bào)道相矛盾。為繼續(xù)探討血管緊張素Ⅱ?qū)a-K-ATPase調(diào)節(jié)的問(wèn)題，我們?cè)诩毙苑蛛x的豚鼠心室肌細(xì)胞上探討了血管緊張素Ⅱ短時(shí)程及長(zhǎng)時(shí)程孵育對(duì)Na-K-ATPase活性的調(diào)控作用，同時(shí)用mRNA和蛋白水平的Na-K-

4、ATPaseα1、α2亞基表達(dá)的變化來(lái)解釋產(chǎn)生這種活性變化的分子基礎(chǔ)。 目的：在急性分離的正常豚鼠心室肌細(xì)胞上，研究血管緊張素Ⅱ分別進(jìn)行短時(shí)程(10分鐘)及長(zhǎng)時(shí)程(24小時(shí))孵育作用后，Na,K-ATPase活性的變化以及這些變化的亞基基礎(chǔ)。 方法：急性分離豚鼠心室肌細(xì)胞：體重在300-500g(1-2月齡)健康豚鼠，雌雄不拘。利用Langendoff裝置進(jìn)行心臟灌流，用Ⅱ型膠原酶急性分離心室肌細(xì)胞。用10-7M的血管緊

5、張素Ⅱ?qū)毙苑蛛x的心室肌細(xì)胞分別進(jìn)行10分鐘和24小時(shí)孵育作用后，測(cè)定Na,K-ATPase活性的變化及其α1、α2亞基表達(dá)的變化。采用Muscella的雙酶分析法[1]測(cè)定豚鼠心室肌Na,K-ATPase的活性，在37℃，波長(zhǎng)340nm處測(cè)定每分鐘NADH吸光值消減率。用NADH吸光值消減率在有無(wú)10-3M的哇巴因存在兩種條件下的差值來(lái)衡量Na,K-ATPase活性，以μmolNADH/mgprotein/h作為Na,K-ATPase

6、活性單位。 采用RT-PCR方法測(cè)定全細(xì)胞的Na,K-ATPaseα1及α2亞基mRNA含量的變化：提取豚鼠心肌總RNA，設(shè)計(jì)兩種α亞基的特異性上下游引物和GAPDH引物，用Oligo(dt)15引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用TaqDNA聚合酶對(duì)兩種α亞基的引物和GAPDH引物進(jìn)行同管PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增片段經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，將長(zhǎng)度相符的條帶在紫外燈下切下并純化回收，隨后將回收的DNA片段測(cè)序，確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物的正確性。 采

7、用western的方法測(cè)定全細(xì)胞的Na,K-ATPaseα1及α2亞基蛋白含量的變化：提取心室肌細(xì)胞總蛋白，用BCA蛋白定量法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，用5％脫脂奶粉25℃振蕩封閉1小時(shí)，加α亞基特異性抗體，4℃孵育12小時(shí)，TBST沈膜四次，二抗稀釋液37℃孵育1小時(shí)，DAB顯色。 采用免疫熒光的方法測(cè)定Na,K-ATPaseα1亞基在胞漿與胞膜的分布變化：將急性分離的豚鼠心室肌細(xì)胞置于24孔板中

8、(鋪有預(yù)先用多聚賴氨酸處理過(guò)的的圓形玻片)爬片，約30分鐘后給予藥物作用，然后用4％多聚甲醛固定一小時(shí)，加入α1及α2一抗四度過(guò)夜，然后加入熒光二抗顯色，37℃避光放置30分鐘后在激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果，通過(guò)掃描圖片進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，以分析心室肌細(xì)胞Na,K-ATPaseα1亞基蛋白在胞漿與胞膜間的轉(zhuǎn)移。 結(jié)果：在急性分離的正常豚鼠心室肌細(xì)胞上，用10-7M血管緊張素Ⅱ進(jìn)行短時(shí)程孵育，其可將Na,K-ATPase活性由10分鐘正

9、常對(duì)照組的298.0±63.4μmolNADH/mgPro/h升高至給藥組的711.1±54.9μmolNADH/mgPro/h(P＜0.01)。而血管緊張素Ⅱ長(zhǎng)時(shí)程孵育后反而降低其活性，由24小時(shí)正常對(duì)照組的169.4±2.1μmolNADH/mgPro/h降至給藥組134.9±16.5μmolNADH/mgPro/h(P＜0.05)。且以上兩種作用均被AT1受體阻斷劑洛沙坦阻斷。 血管緊張素Ⅱ無(wú)論長(zhǎng)時(shí)程孵育還是短時(shí)程孵育，對(duì)

10、心室肌細(xì)胞Na,K-ATPaseα1亞基mRNA表達(dá)含量均無(wú)影響。血管緊張素Ⅱ短時(shí)程作用后不影響α2亞基mRNA表達(dá)，但長(zhǎng)時(shí)程作用后可使α2亞基mRNA含量降低，且此現(xiàn)象可被洛沙坦阻斷。 血管緊張素Ⅱ?qū)π氖壹〖?xì)胞短時(shí)程孵育作用后，全細(xì)胞Na，K-ATPaseα1亞基蛋白含量無(wú)變化，但發(fā)生了從胞漿向胞膜的轉(zhuǎn)移，且洛沙坦可阻斷此現(xiàn)象；血管緊張素Ⅱ長(zhǎng)時(shí)程孵育作用后，Na，K-ATPaseα1亞基蛋白的全細(xì)胞含量及在胞漿與胞膜的含量比值

11、均無(wú)變化；α2未查到。 結(jié)論：在急性分離的正常豚鼠心室肌細(xì)胞中，血管緊張素Ⅱ短時(shí)程(10分鐘)孵育可升高Na，K-ATPase的活性，而長(zhǎng)時(shí)程(24小時(shí))孵育反而抑止Na，K-ATPase的活性，且兩種作用均通過(guò)AT1受體來(lái)實(shí)現(xiàn)。 血管緊張素Ⅱ?qū)π氖壹〖?xì)胞短時(shí)程孵育升高Na，K-ATPase活性的作用與Na，K-ATPaseα1亞基含量表達(dá)從胞漿向胞膜的部分轉(zhuǎn)移相關(guān)；而長(zhǎng)時(shí)程孵育作用對(duì)Na，K-ATPase活性的抑止調(diào)節(jié)