中國(guó)人Brugada綜合征基因突變K317N的功能表達(dá)研究.pdf

1、背景：自從1992年Brugada綜合征被作為一個(gè)臨床綜合征提出來后，人們對(duì)它的認(rèn)識(shí)日漸深入。Brugada綜合征并不是一個(gè)罕見的疾病，在某些國(guó)家，其在青年人的致死原因中排名第二位，僅次于交通意外。其靜止心電圖特征表現(xiàn)為右胸導(dǎo)聯(lián)的ST段持續(xù)抬高和完全或者不完全的右束支傳導(dǎo)阻滯，而反復(fù)發(fā)生多形性室性心動(dòng)過速、心室顫動(dòng)則是導(dǎo)致心性猝死的重要原因。在臨床心臟病學(xué)研究中，用分子遺傳學(xué)的方法來解釋某些心臟結(jié)構(gòu)正常病人心臟猝死的機(jī)制正日益受到重視。

2、近十年的研究表明，編碼人類心臟鈉通道α亞單位的SCN5A基因與Brugada綜合征的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，其原因可能是SCN5A基因的突變?cè)斐闪诵呐K鈉通道蛋白的功能障礙。遺傳性鈉通道的缺陷導(dǎo)致動(dòng)作電位Ⅰ相末內(nèi)向離子流的減弱，Ito占優(yōu)，使動(dòng)作電位平臺(tái)期消失，導(dǎo)致右室跨室壁電壓差(外正內(nèi)負(fù))的形成以及2相復(fù)極不均一，形成了右胸前區(qū)導(dǎo)聯(lián)的ST段抬高及2相折返性室性心律失常的電生理基礎(chǔ)。隨著研究的不斷深入，越來越多的SCN5A基因突變被證實(shí)與Br

3、ugada綜合征有關(guān)，其功能表達(dá)研究顯示，SCN5A基因突變對(duì)人類心臟鈉通道的影響有以下三種：1.鈉通道未能正常表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞上鈉通道數(shù)量的減少。2.電壓和時(shí)間依賴的鈉通道電流的激活、失活和再激活的異常，主要表現(xiàn)為失活加速、復(fù)活減慢或使其通道處于中間狀態(tài)，導(dǎo)致電流的減少。3.在動(dòng)作電位的早期，由于鈉通道失活加速導(dǎo)致INa的減少。在先前的研究中，在一個(gè)中國(guó)人Brugada綜合征家系發(fā)現(xiàn)了SCN5A基因的誤義突變K317N，它位于心臟鈉通道

4、α亞單位SI區(qū)的p-loop區(qū)。而在100個(gè)正常對(duì)照人群中，沒有發(fā)現(xiàn)類似的基因改變。 目的：為進(jìn)一步研究Brugada綜合征發(fā)病的離子、細(xì)胞電生理機(jī)制，擬對(duì)首先在中國(guó)人Brugada綜合征中發(fā)現(xiàn)的新的SCN5A基因突變(K317N)進(jìn)行功能表達(dá)研究，這就需要正確構(gòu)建攜帶已知基因突變的表達(dá)載體。在第一部分中，對(duì)鈉通道基因哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)重組體pRc/CMV-hH1應(yīng)用PCR法進(jìn)行定點(diǎn)誘變，以構(gòu)建攜帶有基因突變K317N的pRc/C

5、MV-hH1(K317N)。在第二部分中，運(yùn)用膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)對(duì)成功轉(zhuǎn)染野生型和突變型SCN5A的293細(xì)胞進(jìn)行電流檢測(cè)。 結(jié)論：成功構(gòu)建了攜帶有K317N基因突變的表達(dá)重組體pRc/CMV-hH1(K317N)，為進(jìn)一步進(jìn)行該突變結(jié)構(gòu)與功能的研究奠定了基礎(chǔ)。大引物誘變法步驟簡(jiǎn)單，成功率高，最終通過DNA測(cè)序，證明定點(diǎn)誘變過程完全成功。野生型hH1所表達(dá)的鈉通道蛋白與正常心肌細(xì)胞鈉通道電生理特性相似。而突變型K317N的表達(dá)