丹參及同屬混淆品種子的系統(tǒng)鑒別研究.pdf

1、丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參的根及根莖，此外，在實際應(yīng)用中還存在一些地方代用品與混淆品，如甘西鼠尾，蔭生鼠尾，雪見草及多種同屬植物。近年來，主產(chǎn)地栽培丹參逐步成為藥材的主要來源，但是，種子市場基源品種混亂，而且同名異物、同物異名現(xiàn)象嚴重。幾種鼠尾草屬植物的種子在外部形態(tài)上非常相近，難以憑感官宏觀鑒別。為確保丹參藥材質(zhì)量的穩(wěn)定、可控，在規(guī)?；⒁?guī)范化種植中首先要保證丹參種源純化、優(yōu)良。本實驗從外觀性狀、顯微特征、理化性質(zhì)等方面，并利用細胞

2、生物學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)及超微技術(shù)對鼠尾草屬幾種植物的種子進行綜合鑒別研究。既有快速、簡便、實用、滿足基層需要的方法又有新技術(shù)與傳統(tǒng)中藥鑒定技術(shù)交叉融合的深層次鑒別研究，也是該省制定中藥種子標準前重要的應(yīng)用基礎(chǔ)研究。 第一部分性狀、顯微、理化鑒別 目的：應(yīng)用快速、簡便、實用的方法，建立丹參、甘西鼠尾、蔭生鼠尾、雪見草種子的外觀性狀、顯微特征、超微特征、理化性質(zhì)方面的綜合鑒別信息指征。 方法： 1.外觀性狀觀

3、察。 2.種皮脫色表面片制備：(1)脫色：取種皮切成12 mm小塊浸入水合氯醛(1：1)溶液中。(2)壓片觀察。 3.石蠟橫切片制備：(1)取材和固定：種子F．A．A固定液固定一周以上。(2)脫水：依次用濃度為70％、80％、90％、95％的乙醇溶液、無水乙醇進行脫水，每隔2～3 h調(diào)換溶液。(3)透明：二甲苯：無水乙醇(1∶1)浸種1～2 h后，轉(zhuǎn)入二甲苯中至種子透明為止。(4)浸蠟：65℃恒溫箱中進行，半小時調(diào)蠟一

4、次，至種子完全浸透。(5)包埋和切片：石蠟包埋，切片厚度12μm。(6)貼片和融蠟。(7)染色：番紅－固綠雙重染色。(8)脫水與封藏。 4.種皮掃描電鏡觀察：(1)清洗：取種子用50％乙醇超聲清洗5min。(2)脫水：50％、60％、70％、80％、90％、100％乙醇逐級脫水，每一級脫水兩次，每次30 min，其間不斷震蕩清洗。(3)固定：戊二醛固定30 min。(4)電鏡觀察：真空噴金后，進行觀察。 5.紫外掃描

5、圖譜特征：(1)取過40目篩的種子粗粉各1.0 g用石油醚索氏提取3 h，制備供試液A；揮干石油醚用乙酸乙酯索氏提取3 h，然后揮干乙酸乙酯用甲醇索氏提取3 h，制備供試液B。(2)掃描波長為200～400 nm的紫外吸收圖譜。(3)圖譜分析。 6.薄層色譜鑒別：(1)取一定量種子粉末用石油醚索氏提取3 h制備供試液C，揮干石油醚用乙酸乙酯索氏提取3 h，制備供試液D，供點樣；(2)點樣，展開。(3)顯色、觀察、照相。

6、 7.高效液相鑒別：提?。杭状妓魇咸崛悠分械某煞?；色譜條件：選用合適的色譜柱，調(diào)整流動相的組成、配比、pH、檢測波長及流速，使樣品中所含成分色譜峰的分離度符合測定要求。 結(jié)論：丹參、甘西鼠尾、蔭生鼠尾和雪見草的種子在外觀性狀、顯微特征、理化性質(zhì)存在差異，可用于鑒別。方法快速、簡便、實用。 第二部分細胞生物學(xué)及分子生物學(xué)特征研究 目的：利用染色體組型分析及種子蛋白質(zhì)PAGE和SDS-PAGE技術(shù)研究藥用丹參品種

7、之間及鼠尾草屬幾種植物種子的綜合鑒別信息指征，從細胞水平及分子水平鑒別真?zhèn)?，并為丹參的品種篩選提供依據(jù)。 方法： 1.根尖體細胞染色體標本片制備：(1)預(yù)處理：種子25℃下萌發(fā)，根尖長0.5～1.0 cm時切取，蒸餾水4℃處理24 h。(2)固定：卡諾固定液(無水乙醇：冰醋酸3∶1)固定10～1.5 h。(3)解離：95％乙醇：濃鹽酸(1∶1)解離10～115min。(4)后低滲：重蒸水低滲，時間8～15 min。(5)

8、染色：改良石炭酸品紅液染色。(6)封片：冰凍揭蓋片，中性樹膠封片。(7)顯微照相、計數(shù)、測量。 2.聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)圖譜特征研究：(1)制備供試品溶液。(2)制備分離膠和濃縮膠。(3)電泳：恒定電壓120～180 V。(4)染色和洗脫：考馬斯亮藍(R-250)染色，脫色液洗脫至背景清晰為止。(5)結(jié)果分析：繪圖并測定特征譜帶泳動率。 3.SDS.聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)圖譜特征研究：(1)