pELNS-BMPs與pELNS-wnt3a聯(lián)合構(gòu)建表達(dá)對(duì)成骨細(xì)胞系成骨效能的作用研究.pdf

1、目的:
　　 骨再生是治療骨骼系統(tǒng)相關(guān)疾病如骨缺損、骨折不連接和治療骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。組織工程骨有望解決植骨后新骨形成緩慢的問題，其中如何促進(jìn)種子細(xì)胞的增殖和成骨分化成為組織工程技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和研究熱點(diǎn)。在促進(jìn)骨形成的眾多調(diào)節(jié)因子中，骨形成蛋白(BMPs)家族在胚胎發(fā)育及骨骼形成中扮演著重要的角色，目前較多研究顯BMP2，BMP4，BMP6，BMP7，BMP9具有骨誘導(dǎo)活性的;另外，Wnt3a在成骨細(xì)胞分化和增殖過程起著重要作

2、用。上述調(diào)節(jié)因子的聯(lián)合作用很可能加強(qiáng)誘導(dǎo)成骨分化，但是有關(guān)的研究少見報(bào)道。
　　 利用基因治療技術(shù)可以將成骨誘導(dǎo)因子導(dǎo)入種子細(xì)胞，通過持續(xù)高水平表達(dá)成骨誘導(dǎo)因子促進(jìn)種子細(xì)胞的成骨分化。選擇理想的載體，使目的基因靶向、可控并有效地表達(dá)，是基因治療成功的關(guān)鍵。非病毒載體系統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)移方法效率較低，其應(yīng)用受到了很大限制;目前常用的病毒性載體主要有逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒等，存在著只能瞬時(shí)表達(dá)、基因丟失、細(xì)胞惡化風(fēng)險(xiǎn)等不足。本研究

3、則使用慢病毒載體并觀察聯(lián)合轉(zhuǎn)染的應(yīng)用前景。以HIV-Ⅰ為基礎(chǔ)構(gòu)建的慢病毒載體具有可感染非分裂細(xì)胞、目的基因整合至靶細(xì)胞基因組長(zhǎng)期表達(dá)、免疫反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)，適于體內(nèi)基因治療，因此有望成為理想的基因轉(zhuǎn)移載體。
　　 本研究擬構(gòu)建第三代自體失活的BMP2，BMP4，BMP6，BMP7，BMP9，Wnt3a慢病毒表達(dá)載體，并整合入小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞MC3T3-E1的基因組中，構(gòu)建成骨誘導(dǎo)因子基因修飾的小鼠類間充質(zhì)干細(xì)胞，探討各成骨誘導(dǎo)因子的

4、成骨分化能力;并通過雙基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染，探討進(jìn)一步提高成骨分化能力的有效方法。
　　 方法:
　　 1.以cDNA文庫(kù)為模板，應(yīng)用PCR方法獲得BMP2，BMP4，BMP6，BMP7，BMP9，Wnt3a基因的編碼序列，擴(kuò)增得到的片段與經(jīng)NheⅠ和SalⅠ雙酶切后與pELNS雙酶切后純化片段連接，構(gòu)建基因表達(dá)質(zhì)粒載體，酶切鑒定重組體并且經(jīng)測(cè)序進(jìn)一步確定。
　　 2.pLP/VSVG, pLP2, pLP1質(zhì)粒與BMP

5、2, BMP4, BMP6, BMP7, BMP9,Wnt3a共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞。包裝pELNS-BMP2，BMP4，BMP6，BMP7，BMP9，Wnt3a后轉(zhuǎn)染小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞，GFP熒光證實(shí)轉(zhuǎn)染效果。 Real time PCR檢測(cè)Runx2 mRNA的表達(dá)水平，鑒定各成骨誘導(dǎo)因子的單獨(dú)轉(zhuǎn)染效能。
　　 3.雙基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染（共8組）MC3T3-E1細(xì)胞，GFP熒光證實(shí)轉(zhuǎn)染效果;應(yīng)用ELISA檢測(cè)MC3

6、T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)上清中BGP和ALP的表達(dá)水平;應(yīng)用Realtime PCR檢測(cè)Runx2 mRNA的表達(dá)水平;應(yīng)用Western blot檢測(cè)BMP2，BMP4，BMP6，BMP7，BMP9，Wnt3a蛋白的表達(dá)水平，鑒定雙基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染的成骨分化效能。
　　 結(jié)果:
　　 1.pELNS-BMP-2, pELNS-BMP-4, pELNS-BMP-6, pELNS-BMP-7,pELNS-BMP-9，pELNS-wn

7、t3a表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　 2.重組慢病毒pELNS-BMP-2，pELNS-BMP-4，pELNS-BMP-6，pELNS-BMP-7，pELNS-BMP-9，pELNS-wnt3a構(gòu)建成功，成功轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細(xì)胞;Runx2mRNA表達(dá)水平:BMP2＞ BMP4＞ BMP9＞ BMP7＞ wnt3a＞ BMP6。
　　 3.雙基因（共8組）聯(lián)合轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細(xì)胞，GFP熒光證實(shí)轉(zhuǎn)染成功;Runx2mR

8、NA表達(dá)水平:T5＞T3＞T8＞T1＞T2＞T6＞T4＞T7;BGP表達(dá):T5＞T3＞T8＞T4＞T2＞T6＞T1＞T7, LP表達(dá):T5＞T3＞T1＞T8＞T2＞T4＞T6＞T7;結(jié)果顯示，T5(BMP-2，BMP-7)共轉(zhuǎn)染成骨效率最高，Western blot證實(shí)BMP2和BMP7聯(lián)合轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細(xì)胞后BMP2，BMP4，BMP6，BMP7，BMP9，Wnt3a蛋白表達(dá)升高。
　　 結(jié)論:
　　 第三代慢病