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文檔簡介
1、目的:子宮內(nèi)膜癌是位居第四位的導(dǎo)致女性死亡的惡性腫瘤,在子宮內(nèi)膜癌腫瘤發(fā)生發(fā)展的血管生成過程中,過度表達(dá)的Tie2基因起到非常重要的作用,為了更好的研究Tie2基因在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用,我們采用RNA干擾技術(shù)敲除Tie2基因,降低Tie2基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá),以研究其功能。
方法我們將表達(dá)Tie2-siRNA的堿基片段插入含有CMV啟動(dòng)子、新霉素抗性基因及綠色熒光蛋白報(bào)告基因的質(zhì)粒中,應(yīng)用脂質(zhì)體包涵體技術(shù)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入子宮
2、內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞株,以減少Tie2基因的表達(dá)。隨后借助綠色熒光蛋白報(bào)告基因及新霉素抗性基因篩選出穩(wěn)定表達(dá)單克隆細(xì)胞株,并采用逆轉(zhuǎn)錄PCR及蛋白印跡方法鑒定。成功獲得穩(wěn)定表達(dá)單克隆細(xì)胞株后,用MTT實(shí)驗(yàn)描繪各組細(xì)胞增殖曲線,DAPI染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡,Transwell實(shí)驗(yàn)估測(cè)細(xì)胞侵襲能力,不同濃度卡鉑處理細(xì)胞檢測(cè)各組細(xì)胞的化療敏感性。
結(jié)果成功篩選出表達(dá)Tie2-siRNA的穩(wěn)定表達(dá)單克隆細(xì)胞株,其
3、Tie2基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)水平抑制率分別為77%及59%,研究發(fā)現(xiàn),Tie2-siRNA組細(xì)胞生長增殖能力下降,凋亡率增加,侵襲能力下降,化療敏感性增加。其細(xì)胞增殖抑制率為73.86%,凋亡率為35.90%,侵襲能力抑制率約63.51%,空白對(duì)照組的卡鉑:IC50為80.55±1.05ug/ml,與其相比,Tie2-siRNA組的卡鉑IC50下降明顯,僅為29.95±0.68ug/ml。
結(jié)論本實(shí)驗(yàn)說明體外下
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