profilin-1在AGEs誘導的血管內皮細胞損傷的作用及機制研究.pdf

1、第一章 Profilin-1在AGEs誘導的內皮損傷中的作用
　　研究背景：
　　糖尿病(diabetes mellitus，DM)發(fā)病率逐年上升，糖尿病血管病變引發(fā)的并發(fā)癥是糖尿病致殘、致死的主要原因之一。而糖尿病患者若長期處于高血糖狀態(tài)后，即使日后長期嚴格控制血糖，糖尿病相關的慢性并發(fā)癥仍繼續(xù)存在甚至發(fā)展，這種現(xiàn)象稱為“代謝記憶(metabolic memory)”或“高血糖記憶(hyperglycemic memory

2、)”。
　　大量研究顯示，若糖尿病患者血糖長期得不到很好的控制，其體內的糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)經(jīng)過一系列的非酶糖化、脂質氧化而產(chǎn)生，導致晚期糖基化終產(chǎn)物（晚期糖化終產(chǎn)物，AGEs）的生成會增加，這些因素可能是生成的“代謝記憶”的主要原因。AGEs介導的“代謝記憶”致血管病變的機制尚未完全闡明。
　　Profilin-1是一種小分子量的肌動蛋白結合蛋白，廣泛存在

3、于除骨骼肌之外的機體組織，可調節(jié)肌動蛋白聚合及解聚過程;參與調節(jié)細胞的增殖、分化和運動過程以及信號轉導。體外研究顯示:AGEs可引起內皮細胞骨架肌動蛋白的重組和再分布，導致內皮細胞通透性增加，提示profilin-1可能是AGEs誘導的內皮細胞損傷的靶分子。
　　本章主要體外培育人臍靜脈內皮細胞，通過外源性的AGEs刺激內皮細胞，觀察AGEs對于內皮細胞的損傷作用，同時觀察profilin-1在AGEs刺激內皮細胞中的表達。

4、>　　方法：
　　培養(yǎng)人臍靜脈血管內皮細胞株，分別用不同濃度(100mg/l，200mg/l，400mg/l) AGEs處理24小時;繼而選用使用AGEs(200mg/l)處理內皮細胞不同時間(6h，12h，24h，48h);使用AGEs(200mg/l，24小時)處理人臍靜脈內皮細胞后，分別檢測細胞上清液NO、ADMA、ICAM-1因子水平，免疫熒光染色檢測F-actin的分布和Profilin-1的表達，Western blo

5、t檢測profilin-1蛋白表達，共聚焦掃描顯微鏡直接觀察活性氧的改變。
　　結果：
　　1、不同濃度的AGEs(100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L)孵育內皮細胞24 h均可使Profilin-1蛋白表達上調，但以200 mg/L明顯。
　　2、200 mg/L的AGEs呈時間依賴性的上調內皮細胞Profilin-1的蛋白表達，后續(xù)實驗均選用200 mg/L作用內皮細胞24小時。
　　3、AG

6、Es誘導的profilin-1對內皮細胞結構的改變。
　　4、AGEs(200 mg/L)處理內皮細胞24 h可顯著升高細胞培養(yǎng)上清液中ADMA、ICAM-1水平，降低NO水平。
　　5、AGEs(200 mg/L)處理內皮細胞24 h后，細胞形態(tài)變得很不規(guī)則，綠色熒光明顯增加，提示AGEs明顯增加細胞內活性氧水平。
　　結論：
　　Profilin-1在AGEs介導的血管內皮損傷過程中起到關鍵的作用。
　

7、　第二章 Profilin-1基因沉默后AGEs誘導的內皮細胞的表達
　　研究背景：
　　糖尿病血管病變的發(fā)病機制復雜，迄今仍未闡明。目前普遍的觀點認為:長期的高血糖使線粒體功能下降，產(chǎn)生過量的超氧化物，細胞蛋白、核酸被糖化導致大量的AGEs生成，AGEs本身可直接修飾線粒體蛋白，抑制其修復，生成更多的超氧離子。這種損害隨著高血糖時間延長而積累，此時即使糾正高血糖，AGEs的損害仍持續(xù)存在，其導致的血管損傷仍會繼續(xù)加速血管病

8、變的進展。近年來有學者提出線粒體AGEs形成是不可逆的現(xiàn)象，可以解釋長期“代謝記憶”的本質的觀點。AGEs的間接作用主要是由其受體(receptor for advancedglycation end products，RAGE)介導，AGEs與RAGE結合后，誘導細胞內氧自由基大量產(chǎn)生，后者作為信號分子通過細胞內信號級聯(lián)反應，激活蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）和核因子-B(nuclear factorkappa

9、 B，NF-B)，最終活化糖尿病相關并發(fā)癥發(fā)生的通路。
　　基于此，我們進行了關鍵的預實驗，結果發(fā)現(xiàn):STZ糖尿病大鼠主動脈profilin-1表達增加;在培養(yǎng)的內皮細胞，高糖(30 mM，24 h)刺激對profilin-1的表達沒有影響，而給予AGEs(50 g/ml，24 h)處理后可顯著上調profilin-1的表達，這一現(xiàn)象與長時間高糖刺激AGEs形成后介導的“代謝記憶”相吻合。因此，我們推測profilin-1很可能與

10、AGEs介導的“代謝記憶”相關，以profilin-1為靶點展開研究有望更清晰的闡釋“代謝記憶”的發(fā)生機制，并從細胞內途徑阻斷AGEs誘導的血管損傷。
　　在先前的實驗已經(jīng)證實了profilin-1介導的AGEs在內皮細胞損傷中的作用。而本章課題設計AGEs依賴的profilin-1表達上調機制及信號轉導通路;并應用基因沉默技術，直接論證profilin-1在AGEs誘導的血管內皮損傷和血管病變中的關鍵作用，試圖尋找新的抗血管病變

11、發(fā)生的作用靶點，為開發(fā)和研制新藥提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　培養(yǎng)人臍靜脈血管內皮細胞株，并由上海吉凱基因化學技術有限公司合成profilin-1 siRNA質粒，將profilin-1 siRNA質粒成功轉染人臍靜脈血管內皮細胞株，采用Real-Time PCR及Werstem-Blot法檢測profilin-1基因沉默效果;采用AGEs+Profilin-1干擾組、AGEs+ DPI(10umol/l)組、AGEs+B

12、AY-117802(5umol/l)組、AGEs+GF109203X(10umol/l)組分組，分別檢測其profilin-1的表達，以及細胞上清液中ADMA、ICAM-1、NO水平。PKC與NF-KB信號轉導途徑抑制劑預處理正常人臍靜脈血管細胞株，以此來證明AGEs誘導的內皮細胞損傷的信號通路的可能機制。
　　結果
　　1、AGEs組誘導的Profilin-1表達明顯高于對照組(P＜0.05)以及AGEs+Profilin

13、-1干擾組(P＜0.01)（圖2-1）。
　　2、經(jīng)pLNCX2-Profilin-1干擾質粒以及給予各種抑制劑孵育內皮細胞可明顯減少AGEs所致的ADMA、ICAM-1水平的升高，且增加NO的生成。
　　3、AGEs組誘導的Profilin-1表達較各個抑制劑組以及AGEs+Profilin-1干擾組明顯升高;各個抑制組與AGEs+Profilin-1干擾組的細胞profilin-1 mRNA表達與AGEs組相比明顯降低。

14、
　　4、AGEs組較其他組相比較，內皮細胞24 h后細胞形態(tài)變得很不規(guī)則，綠色熒光明顯增加，提示AGEs明顯增加細胞內活性氧水平。
　　5、免疫熒光染色顯示使用AGEs組其綠色熒光水平明顯高于對照組，其進一步表明，在使用AGEs(200g/ml)孵化24 h后其profilin-1的表達水平明顯上調。使用DPI，GF109203 x和BAY-117082等抑制劑處理后，其表達profilin-1的綠色熒光顯著降低，表明其p

15、rofilin-1的生成由于使用DPI，GF109203 x和BAY-117082等抑制劑后而減少。
　　6、免疫熒光染色顯示，沉默profilin-1基因表達顯著減少細胞質中profilin-1的表達，并且改善了由于AGEs誘導的F-肌動蛋白重組及分布。總的來說，這些結果證實AGEs通過增加profilin-1在細胞質中的水平，從而誘導內皮細胞肌動蛋白細胞骨架重組以及再分配。并通過PKC和NF-κB通路作為AGEs介導的prof

16、ilin-1的激活。
　　結論
　　沉默profilin-1基因可以使AGEs誘導的內皮細胞損傷顯著改善，且profilin-1可能是內皮損傷最終的和共同的下游效應。
　　第三章 AGEs介導的大鼠中profilin-1的表達
　　研究背景：
　　2010年，根據(jù)ADA（美國糖尿病協(xié)會）的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，我們可以發(fā)現(xiàn)長期（3年以上）糖尿病患者，其出現(xiàn)并發(fā)癥的幾率將近5成，而更長期（5年以上）的糖尿病患者，出現(xiàn)并發(fā)

17、癥的幾率甚至達到了6成以上，而超長期（10年以上）的糖尿病患者，出現(xiàn)并發(fā)癥的幾率機會是100％。隨著對于糖尿病的認識的深入，越來越多的糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者被發(fā)現(xiàn)，而大部分糖尿病患者發(fā)現(xiàn)有糖尿病的時候，其導致的血管病變所引發(fā)的并發(fā)癥是糖尿病致殘、致死的主要原因之一。對于那些長期高血糖的患者，包括嚴格控制血糖及強效降脂等在內的綜合治療手段并不能有效防止糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。因此，深入探討糖尿病血管病變

18、的發(fā)生機制，而糖尿病血管病變包括許多的方面。
　　我們先前的體外實驗已經(jīng)證實了AGEs誘導的profilin-1表達的增加，從而導致了內皮細胞的損傷，并且證實了通過PKC和NF-κB通路作為細胞信號通道。
　　本課題擬在AGEs誘導的血管病變大鼠模型，試圖證明在動物體內其AGEs仍然通過profilin-1的表達，從而導致血管的受損，進而導致糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生。為尋找新的抗血管病變發(fā)生的作用靶點，為開發(fā)和研制新藥提供理論依據(jù)

19、。
　　方法：
　　采用SD大鼠尾靜脈注射AGEs-BSA(25mg/kg，iM qd，連續(xù)2月)誘導血管損傷模型，采用HE染色、免疫組化(Immunohisto-chemistry，IHC)檢測組織形態(tài)學變化及相關指標的改變，采用Westernblot及real-time PCR檢測主動脈profilin-1的表達。
　　結果：
　　1、各組大鼠實驗前體重情況比較無明顯差異。
　　2、HE染色可見AGEs

20、組與對照組大鼠相比，隨著使用AGEs培育時間的延長，其內皮細胞以及血管形態(tài)均發(fā)生改變。腎臟組織的免疫組化示:AGEs組大鼠隨著使用AGEs培育時間的延長，腎小球受損傷，以及可見炎癥分布和淋巴細胞浸潤。
　　3、與正常對照組相比，隨尾靜脈給藥時問的增加profilin-1蛋白表達量明顯增加;且profilin-1 mRNA表達量明顯增加。
　　4、隨著使用尾靜脈注射AGEs時間的延長，大鼠的ICAM-1以及ADMA的水平與對照