profilin-1在AGEs誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一章 Profilin-1在AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷中的作用
　　研究背景：
　　糖尿病(diabetes mellitus，DM)發(fā)病率逐年上升，糖尿病血管病變引發(fā)的并發(fā)癥是糖尿病致殘、致死的主要原因之一。而糖尿病患者若長期處于高血糖狀態(tài)后，即使日后長期嚴(yán)格控制血糖，糖尿病相關(guān)的慢性并發(fā)癥仍繼續(xù)存在甚至發(fā)展，這種現(xiàn)象稱為“代謝記憶(metabolic memory)”或“高血糖記憶(hyperglycemic memory

2、)”。
　　大量研究顯示，若糖尿病患者血糖長期得不到很好的控制，其體內(nèi)的糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)經(jīng)過一系列的非酶糖化、脂質(zhì)氧化而產(chǎn)生，導(dǎo)致晚期糖基化終產(chǎn)物（晚期糖化終產(chǎn)物，AGEs）的生成會增加，這些因素可能是生成的“代謝記憶”的主要原因。AGEs介導(dǎo)的“代謝記憶”致血管病變的機(jī)制尚未完全闡明。
　　Profilin-1是一種小分子量的肌動蛋白結(jié)合蛋白，廣泛存在

3、于除骨骼肌之外的機(jī)體組織，可調(diào)節(jié)肌動蛋白聚合及解聚過程;參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和運(yùn)動過程以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。體外研究顯示:AGEs可引起內(nèi)皮細(xì)胞骨架肌動蛋白的重組和再分布，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，提示profilin-1可能是AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的靶分子。
　　本章主要體外培育人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，通過外源性的AGEs刺激內(nèi)皮細(xì)胞，觀察AGEs對于內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用，同時觀察profilin-1在AGEs刺激內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)。

4、>　　方法：
　　培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株，分別用不同濃度(100mg/l，200mg/l，400mg/l) AGEs處理24小時;繼而選用使用AGEs(200mg/l)處理內(nèi)皮細(xì)胞不同時間(6h，12h，24h，48h);使用AGEs(200mg/l，24小時)處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后，分別檢測細(xì)胞上清液NO、ADMA、ICAM-1因子水平，免疫熒光染色檢測F-actin的分布和Profilin-1的表達(dá)，Western blo

5、t檢測profilin-1蛋白表達(dá)，共聚焦掃描顯微鏡直接觀察活性氧的改變。
　　結(jié)果：
　　1、不同濃度的AGEs(100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L)孵育內(nèi)皮細(xì)胞24 h均可使Profilin-1蛋白表達(dá)上調(diào)，但以200 mg/L明顯。
　　2、200 mg/L的AGEs呈時間依賴性的上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞Profilin-1的蛋白表達(dá)，后續(xù)實驗均選用200 mg/L作用內(nèi)皮細(xì)胞24小時。
　　3、AG

6、Es誘導(dǎo)的profilin-1對內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變。
　　4、AGEs(200 mg/L)處理內(nèi)皮細(xì)胞24 h可顯著升高細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ADMA、ICAM-1水平，降低NO水平。
　　5、AGEs(200 mg/L)處理內(nèi)皮細(xì)胞24 h后，細(xì)胞形態(tài)變得很不規(guī)則，綠色熒光明顯增加，提示AGEs明顯增加細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。
　　結(jié)論：
　　Profilin-1在AGEs介導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷過程中起到關(guān)鍵的作用。
　

7、　第二章 Profilin-1基因沉默后AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)
　　研究背景：
　　糖尿病血管病變的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，迄今仍未闡明。目前普遍的觀點認(rèn)為:長期的高血糖使線粒體功能下降，產(chǎn)生過量的超氧化物，細(xì)胞蛋白、核酸被糖化導(dǎo)致大量的AGEs生成，AGEs本身可直接修飾線粒體蛋白，抑制其修復(fù)，生成更多的超氧離子。這種損害隨著高血糖時間延長而積累，此時即使糾正高血糖，AGEs的損害仍持續(xù)存在，其導(dǎo)致的血管損傷仍會繼續(xù)加速血管病

8、變的進(jìn)展。近年來有學(xué)者提出線粒體AGEs形成是不可逆的現(xiàn)象，可以解釋長期“代謝記憶”的本質(zhì)的觀點。AGEs的間接作用主要是由其受體(receptor for advancedglycation end products，RAGE)介導(dǎo)，AGEs與RAGE結(jié)合后，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)氧自由基大量產(chǎn)生，后者作為信號分子通過細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)，激活蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）和核因子-B(nuclear factorkappa

9、 B，NF-B)，最終活化糖尿病相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生的通路。
　　基于此，我們進(jìn)行了關(guān)鍵的預(yù)實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn):STZ糖尿病大鼠主動脈profilin-1表達(dá)增加;在培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞，高糖(30 mM，24 h)刺激對profilin-1的表達(dá)沒有影響，而給予AGEs(50 g/ml，24 h)處理后可顯著上調(diào)profilin-1的表達(dá)，這一現(xiàn)象與長時間高糖刺激AGEs形成后介導(dǎo)的“代謝記憶”相吻合。因此，我們推測profilin-1很可能與

10、AGEs介導(dǎo)的“代謝記憶”相關(guān)，以profilin-1為靶點展開研究有望更清晰的闡釋“代謝記憶”的發(fā)生機(jī)制，并從細(xì)胞內(nèi)途徑阻斷AGEs誘導(dǎo)的血管損傷。
　　在先前的實驗已經(jīng)證實了profilin-1介導(dǎo)的AGEs在內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用。而本章課題設(shè)計AGEs依賴的profilin-1表達(dá)上調(diào)機(jī)制及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路;并應(yīng)用基因沉默技術(shù)，直接論證profilin-1在AGEs誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷和血管病變中的關(guān)鍵作用，試圖尋找新的抗血管病變

11、發(fā)生的作用靶點，為開發(fā)和研制新藥提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株，并由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成profilin-1 siRNA質(zhì)粒，將profilin-1 siRNA質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株，采用Real-Time PCR及Werstem-Blot法檢測profilin-1基因沉默效果;采用AGEs+Profilin-1干擾組、AGEs+ DPI(10umol/l)組、AGEs+B

12、AY-117802(5umol/l)組、AGEs+GF109203X(10umol/l)組分組，分別檢測其profilin-1的表達(dá)，以及細(xì)胞上清液中ADMA、ICAM-1、NO水平。PKC與NF-KB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑預(yù)處理正常人臍靜脈血管細(xì)胞株，以此來證明AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的信號通路的可能機(jī)制。
　　結(jié)果
　　1、AGEs組誘導(dǎo)的Profilin-1表達(dá)明顯高于對照組(P＜0.05)以及AGEs+Profilin

13、-1干擾組(P＜0.01)（圖2-1）。
　　2、經(jīng)pLNCX2-Profilin-1干擾質(zhì)粒以及給予各種抑制劑孵育內(nèi)皮細(xì)胞可明顯減少AGEs所致的ADMA、ICAM-1水平的升高，且增加NO的生成。
　　3、AGEs組誘導(dǎo)的Profilin-1表達(dá)較各個抑制劑組以及AGEs+Profilin-1干擾組明顯升高;各個抑制組與AGEs+Profilin-1干擾組的細(xì)胞profilin-1 mRNA表達(dá)與AGEs組相比明顯降低。

14、
　　4、AGEs組較其他組相比較，內(nèi)皮細(xì)胞24 h后細(xì)胞形態(tài)變得很不規(guī)則，綠色熒光明顯增加，提示AGEs明顯增加細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。
　　5、免疫熒光染色顯示使用AGEs組其綠色熒光水平明顯高于對照組，其進(jìn)一步表明，在使用AGEs(200g/ml)孵化24 h后其profilin-1的表達(dá)水平明顯上調(diào)。使用DPI，GF109203 x和BAY-117082等抑制劑處理后，其表達(dá)profilin-1的綠色熒光顯著降低，表明其p

15、rofilin-1的生成由于使用DPI，GF109203 x和BAY-117082等抑制劑后而減少。
　　6、免疫熒光染色顯示，沉默profilin-1基因表達(dá)顯著減少細(xì)胞質(zhì)中profilin-1的表達(dá)，并且改善了由于AGEs誘導(dǎo)的F-肌動蛋白重組及分布。總的來說，這些結(jié)果證實AGEs通過增加profilin-1在細(xì)胞質(zhì)中的水平，從而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞肌動蛋白細(xì)胞骨架重組以及再分配。并通過PKC和NF-κB通路作為AGEs介導(dǎo)的prof

16、ilin-1的激活。
　　結(jié)論
　　沉默profilin-1基因可以使AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷顯著改善，且profilin-1可能是內(nèi)皮損傷最終的和共同的下游效應(yīng)。
　　第三章 AGEs介導(dǎo)的大鼠中profilin-1的表達(dá)
　　研究背景：
　　2010年，根據(jù)ADA（美國糖尿病協(xié)會）的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，我們可以發(fā)現(xiàn)長期（3年以上）糖尿病患者，其出現(xiàn)并發(fā)癥的幾率將近5成，而更長期（5年以上）的糖尿病患者，出現(xiàn)并發(fā)

17、癥的幾率甚至達(dá)到了6成以上，而超長期（10年以上）的糖尿病患者，出現(xiàn)并發(fā)癥的幾率機(jī)會是100％。隨著對于糖尿病的認(rèn)識的深入，越來越多的糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者被發(fā)現(xiàn)，而大部分糖尿病患者發(fā)現(xiàn)有糖尿病的時候，其導(dǎo)致的血管病變所引發(fā)的并發(fā)癥是糖尿病致殘、致死的主要原因之一。對于那些長期高血糖的患者，包括嚴(yán)格控制血糖及強(qiáng)效降脂等在內(nèi)的綜合治療手段并不能有效防止糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。因此，深入探討糖尿病血管病變

18、的發(fā)生機(jī)制，而糖尿病血管病變包括許多的方面。
　　我們先前的體外實驗已經(jīng)證實了AGEs誘導(dǎo)的profilin-1表達(dá)的增加，從而導(dǎo)致了內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，并且證實了通過PKC和NF-κB通路作為細(xì)胞信號通道。
　　本課題擬在AGEs誘導(dǎo)的血管病變大鼠模型，試圖證明在動物體內(nèi)其AGEs仍然通過profilin-1的表達(dá)，從而導(dǎo)致血管的受損，進(jìn)而導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生。為尋找新的抗血管病變發(fā)生的作用靶點，為開發(fā)和研制新藥提供理論依據(jù)

19、。
　　方法：
　　采用SD大鼠尾靜脈注射AGEs-BSA(25mg/kg，iM qd，連續(xù)2月)誘導(dǎo)血管損傷模型，采用HE染色、免疫組化(Immunohisto-chemistry，IHC)檢測組織形態(tài)學(xué)變化及相關(guān)指標(biāo)的改變，采用Westernblot及real-time PCR檢測主動脈profilin-1的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1、各組大鼠實驗前體重情況比較無明顯差異。
　　2、HE染色可見AGEs

20、組與對照組大鼠相比，隨著使用AGEs培育時間的延長，其內(nèi)皮細(xì)胞以及血管形態(tài)均發(fā)生改變。腎臟組織的免疫組化示:AGEs組大鼠隨著使用AGEs培育時間的延長，腎小球受損傷，以及可見炎癥分布和淋巴細(xì)胞浸潤。
　　3、與正常對照組相比，隨尾靜脈給藥時問的增加profilin-1蛋白表達(dá)量明顯增加;且profilin-1 mRNA表達(dá)量明顯增加。
　　4、隨著使用尾靜脈注射AGEs時間的延長，大鼠的ICAM-1以及ADMA的水平與對照