芳維A酸乙酯對銀屑病樣小鼠模型的藥效學試驗.pdf

1、目的：檢驗芳維A酸乙酯(Arotinoid Ethylester，AE)對小鼠銀屑病樣模型在抗表皮細胞增殖、誘導異常增生的表皮細胞凋亡、促進表皮顆粒層細胞增生、抑制炎癥、抑制中性粒細胞(PMN)趨化性等方面的藥效學作用。 實驗動物及分組： 材料與方法： 1、實驗動物： 清潔級成年BALB/c小鼠，雌雄各半，體重20±5g。購自中國醫(yī)學科學院實驗動物研究中心。 2、分組：小鼠隨機分組如下：

2、2.1組：即銀屑病樣增生模型治療組：230只小鼠隨機分為7個試驗劑量組，每組30-40只，每組又分3-4個時點(0W、2W、4W、6W)組。并設立正常對照組(未建模型未用藥組)及模型對照組(建立模型后未用藥組)，每組10只，雌雄各半。模型建立后，按照不同試驗劑量組別分別給予不同藥物灌胃給藥。分別在模型建立當日(0W)、給藥后2W、4w、6W各時點分別取出各試驗劑量組(每組10只)小鼠，斷頸處死，取背部皮膚標本分成三份，分別用OCT包埋存

3、放于-20℃冰箱、4％福爾馬林固定、-80℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?2.2組：即小鼠耳部炎癥模型治療組： 70只小鼠隨機分為7個試驗劑量組正常對照組，模型對照組，溶劑對照組(服植物油組)，陽性對照組(阿維A酸組)，低劑量AE試驗組，中劑量AE試驗組，高劑量AE試驗組)，每組10只，雌雄各半。將50μl的巴豆油滴于各組小鼠右耳(正常對照組除外)，30分鐘后灌胃給藥。左耳作空白對照。2小時后將小鼠斷頸處死，沿耳廓基線剪下左右兩耳，用

4、直徑6mm的打孔器分別在左右耳同一部位打下圓耳片，電子秤稱重。 2．3組：即誘導小鼠尾部鱗片表皮顆粒層細胞增生組：72只小鼠分二組，每組分別由36只小鼠隨機分6小組，每小組6只，雌雄各半。所有小鼠每日用棉簽分別蘸取不同藥物涂抹鼠尾10和14次各為一療程。分別處死小鼠36只，在距鼠尾基底部以下2cm處切斷尾巴。切下皮膚，立即在70％酒精中固定，石蠟包埋，作組織學檢查。 二、小鼠銀屑病樣模型的建立及檢測： 1、銀屑病樣增生模

5、型于試驗前一天用脫毛劑脫去小鼠背部毛。分別于第1天和和第8天于背部脫毛區(qū)(2.5cm×2cm)涂0.75％DMBA(150μg/200μl丙酮液)；第15天起在相同部位涂0.25％巴豆油(50μg/200μl丙酮液)，每周2次，共4周。分別于建模當天(0W)、給藥2W、4W、6W后引頸處死各組小鼠，取材備用。 2、對銀屑病樣增生病變的治療作用的檢測： 2.1皮膚的IL-8RⅡ(CXCR<,2>)的測定(免疫組化法)；

6、 2.2皮膚的TNF-α的p75受體的測定(免疫組化法)； 2.3皮膚的表皮細胞層數檢測(H.E.染色)； 2.4表皮PCNA的測定(免疫組化法)； 2.5皮膚的Bax的測定(免疫組化法)。 三、對小鼠尾部鱗片顆粒細胞增生誘導的檢測： 在光學顯微鏡下觀察每個小鼠的尾部鱗片。凡鱗片表皮有連續(xù)成行的顆粒細胞者，稱為有顆粒層形成的鱗片。計數每10個鱗片中有顆粒層形成的鱗片數，對各組數據進行比較。

7、 四、對小鼠耳部炎癥模型作用的檢測： 1、耳重量的檢測： 將巴豆油造成小鼠耳炎癥模型后予不同藥物灌胃2小時后，用直徑6mm的打孔器取下的病側(右耳)與正常對照側(左耳)耳殼，立即用電子天平稱重，計算二者重量之差，作為腫脹度，比較各試驗劑量組間腫脹度差異的顯著性，并計算炎癥抑制率。 2、檢測指標： 2．1腫脹度：左右耳重量之差。 2．2炎癥抑制率：(1-實驗組耳腫脹度/對照組腫脹度)×100％。

8、 五、統(tǒng)計學分析及處理： 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，所有數據均以x±SD表示，計量資料采用單因素方差分析(One Way ANOVA)，計數資料采用秩和檢驗。 結果： 一、對小鼠銀屑病樣增生病變的治療作用： 1、對小鼠銀屑病樣增生表皮IL-8RⅡ(CXCR<,2>)的檢測： (1)模型對照組IL-8R Ⅱ的表達水平明顯高于正常對照組，且表達量隨巴豆油的不斷刺激而增加；不同時間點的表達分

9、別為：0(0W)、23±13.64(2W)、46±13.56(4W)、16.11±3.93(6W)。(巴豆油4W以后因刺激大而逐漸減量)。 (2)高劑量AE組IL-8RⅡ的表達最低，且隨給藥時間延長而呈遞減趨勢，即有一定的時間依賴性；高劑量AE組IL-8RⅡ的表達在每個時間點均比中、低劑量AE組低，尤其在給藥后期(6W)與中劑量AE組差異顯著(P<0.05)，呈現一定的劑效性。 (3)陽性對照(阿維A酸)組在給藥初期(2

10、W、4w)表達IL-8RⅡ明顯少于三個AE組(P<0.05)，但隨給藥時間的延長出現了高表達，與三個AE組比較差異顯著(6W與低、高劑量AE組比較P=0.017/0.038)。 2、對小鼠銀屑病樣增生表皮TNFR-p75的檢測： (1)模型對照組TNFR-p75的表達水平明顯高于正常對照組，且表達量隨巴豆油的不斷刺激而增加；不同時點的表達分別為：0(0W)、20.5±8.5(2W)、27.14±11.61(4W)、12.

11、78±6.29(6W)。 (2)給藥早期，三個AE組及阿維A酸組均明顯抑制TNFR-p75表達(與模型對照組比較均P<0.01)。三個AE組在各時點都比阿維A酸組表達量少，有統(tǒng)計學差異：早期(2W)阿維A酸組與高劑量AE組差異明顯(P=0.006)，后期(6W)表達明顯升高，甚至高于模型對照組，與低劑量AE組差異顯著(P=0.005)。 (3)三個AE組表現出：早期高劑量組表達明顯比低劑量組少(P=0.03)，但隨給藥時

12、間延長，晚期中、高劑量組表達呈增高趨勢；低劑量組則無明顯增高，　 3、對小鼠銀屑病樣增生表皮PCNA的檢測： (1)三個AE組抑制表皮PCNA的表達作用隨劑量增大而呈遞減趨勢，低劑量組隨時間延長抑制作用加強。在6W時三個AE組PCNA的表達分別為：53.2±21.04(高劑量AE組)、46.0±7.38(中劑量．AE組)、27.75±4.94(低劑量AE組)；只有低劑量AE組與模型對照組差異顯著(P<0.01)。

13、 (2)阿維A酸組在不同時間點均能抑制表皮PCNA的表達，但在給藥后期(6W)抑制作用明顯弱于低劑量AE組。在6W時PCNA的表達分別為：35.0±9.48(陽性對照組)、27.75±4.94(低劑量AE組)。 4、對小鼠銀屑病樣增生表皮Bax的檢測： (1)三個AE組均能抑制Bax的表達，且作用隨劑量升高而有加強趨勢，差異有統(tǒng)計學意義。中、高劑量組呈現一定的時間依賴性，Bax的表達隨AE給藥時間延長呈增強趨勢。

14、 (2)阿維A酸組在三個時間點表達Bax均弱于三個AE組，與高劑量AE組差異更顯著(P<0.01)。 5、對小鼠銀屑病樣增生表皮細胞層數的檢測： (1)三個AE組表現為先促進異常增生的表皮進一步增生，后抑制增生； 且隨給藥時間的延長抑制增生作用加強，與4W時比較，三個AE組在6W時的表皮層數差異均非常顯著(均為P<0.01)，呈現明顯的時效性；同時又有一定的劑效性：劑量越小，抑制作用越強。表皮層數分別為：低劑量組

15、：2.0±0(2W)、2.22±0.42(4W)、1.5±0.5(6W)；中劑量組：2.44±0.50(2W)、3.0±0(4W)、2.2±0.6(6W)；高劑量組：2.86±0.35(2W)、3.0±0(4W)、2.2±0.4(6W)。 (2)阿維A酸組開始即表現出較好的抑制表皮增生作用，但沒有明顯隨給藥時間延長而抑制作用加強，顯示其時效性不如AE。表皮層數分別為：1.3±0.46(2W)、2.0±0(4W)、1.6±0.49(6W)

16、。 二、對小鼠耳巴豆油致炎模型的治療作用。 三、對小鼠尾部鱗片表皮顆粒層細胞增生的作用。 結論： 1、DMBA/巴豆油較成功地誘發(fā)了小鼠表皮銀屑病樣增生模型，其所造成的增殖病變中，KC過度增生、皮膚炎癥改變以及某些生化、細胞因子和免疫學的改變，與銀屑病的改變相似。 2、三個AE組均有抗炎、抗白細胞趨化性作用，但用藥早期，較大劑量作用明顯，長期用藥則高劑量出現炎癥加重反應；阿維A酸組在用藥早期作用明

17、顯，但長期用藥出現明顯的炎癥加重反應。 3、AE抑制表皮細胞增生的藥效既具有時間依賴性：用藥時間越長，抑制增生的作用越明顯，即有時效性的特點；又有劑量依賴性，小劑量組的抑制表皮增生作用更為明顯。阿維A酸開始即表現出較明顯的抑制表皮增生作用，但長期用藥的時效性不如低劑量AE。 4、AE及阿維A酸對異常增殖的表皮細胞均有誘導凋亡作用，AE的這種誘導凋亡作用，既有一定的劑效性，又有一定的時效性：劑量越高，給藥時間越長(主要是中