靶向角蛋白17反義寡核苷酸和siRNA對銀屑病SCID小鼠模型的治療作用.pdf

1、銀屑病是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，一定的遺傳背景、感染作為誘因、以T細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫紊亂是銀屑病發(fā)病機(jī)理中的三個重要環(huán)節(jié)。角蛋白17（K17）是相對分子量（Mr）為46000的Ⅰ型角蛋白，在正常表皮不表達(dá)（主要分布在生長期毛囊、汗腺等組織），而在銀屑病皮損處呈高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，K17與鏈球菌M蛋白具有交叉抗原特性，其表面含有多個T淋巴細(xì)胞活化表位，能夠刺激T細(xì)胞，使之活化、增生、釋放炎癥因子γ干擾素（IFNγ）等，而IFNγ又能夠誘

2、導(dǎo)增加K17的表達(dá)，從而在K17和T細(xì)胞之間形成一個相互促進(jìn)的環(huán)路，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和表皮細(xì)胞異常增生等病理改變，是銀屑病發(fā)病機(jī)理中的重要環(huán)節(jié)。鑒于K17在銀屑病病理過程中的特殊意義和關(guān)鍵作用，我們提出將K17作為治療銀屑病的一個新的藥物作用靶點(diǎn)，探討更加特異和有效的治療策略。 我們以往的研究發(fā)現(xiàn)，抗角蛋白多克隆自身抗體和抗角蛋白17單克隆抗體均能夠以劑量依賴的方式抑制表皮角質(zhì)形成細(xì)胞（KC）的增生，在銀屑病體外模型和普萘洛爾誘導(dǎo)的

3、銀屑病樣皮炎動物模型中，均可以逆轉(zhuǎn)包括KC異常增生、炎癥性細(xì)胞因子過度表達(dá)等在內(nèi)的一系列病理改變，顯示出對銀屑病良好的治療效果。在此基礎(chǔ)上，本課題組應(yīng)用反義技術(shù)及RNA干涉（RNAi）技術(shù)，將針對K17的反義寡核苷酸（K17－ASODN）以及小干涉RNA（K17－siRNA）轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者均能抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的增生，并誘導(dǎo)其凋亡。 本研究的目的是通過在體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證K17－ASODN和siRNA對銀屑

4、病的治療作用，確認(rèn)K17作為治療銀屑病的藥物作用靶點(diǎn)。我們采用目前公認(rèn)的重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠銀屑病皮損移植模型，將K17－ASODN和siRNA用脂質(zhì)體包裹，局部外用于移植皮損，繼而通過移植皮片的大體改變和組織病理學(xué)等特征觀察治療效果，并采用反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）以及免疫組化的方法分別從核酸及蛋白水平檢測了K17的變化，為研究銀屑病新的基因治療策略進(jìn)行了積極的嘗試。 本研究的主要實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果如下： 一

5、、銀屑病SCID小鼠動物模型的構(gòu)建 1. 供體、受體來源 移植皮片均來自我科新入院、本次入院前未作任何治療的斑塊型銀屑病患者，所有患者均簽署知情同意書，并經(jīng)第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院倫理委員會審查許可。SCID小鼠（6-8周齡）購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物中心，飼養(yǎng)于本校實(shí)驗(yàn)動物中心(SPF環(huán)境)。 2. 動物模型的構(gòu)建 切取銀屑病患者皮損約5×5cm2大小，作為移植供體。將所獲取的皮片剪成直徑為0.8cm2的正方形

6、皮片5小塊，分別移植給5只SCID小鼠。移植后10天，移植皮片周圍分點(diǎn)皮下注射經(jīng)刀豆蛋白刺激的銀屑病患者外周血單一核細(xì)胞（PBMCs），細(xì)胞數(shù)約為1×106/鼠。移植后15天，絕大多數(shù)移植皮片外觀和組織病理學(xué)特征呈明顯的銀屑病改變。我們根據(jù)Baker評分法，對所有的移植模型進(jìn)行評分，結(jié)果為8.042±0.838，免疫組化提示移植表皮基底層上方KC高表達(dá)K17。因此從大體表現(xiàn)、組織病理和免疫學(xué)方面，移植皮片均能保留銀屑病的表型特點(diǎn)，表明銀

7、屑病SCID小鼠動物模型構(gòu)建成功。 二、K17－ASODN對銀屑病SCID小鼠模型的作用 1. K17－ASODN的合成 按我們以往建立的方法，設(shè)計針對K17mRNA蛋白編碼區(qū)位點(diǎn)的有效ASODN序列：5’GCCAGCAGCCCATCAACA 3’，另外合成一段正義寡核苷酸（SODN）序列作為對照：5’TGTTGATGGGCTGCTGGC 3’。二者均經(jīng)硫代磷酸化修飾，由上海生物技術(shù)公司合成。 2. 分組

8、及給藥 將構(gòu)建好的動物模型隨機(jī)分為3組，每組4只，分別對應(yīng)以下處理：K17- ASODN治療組：15μg（5μl）K17-ASODN 加30μl脂質(zhì)體，臨時配制于25μl乳劑基質(zhì)中，均勻涂抹于移植皮片，間隔2天給藥一次，連續(xù)給藥5次，療程15天；K17-SODN對照組：以K17-SODN取代ASODN，劑量、配制及外用方法同ASODN組；乳劑基質(zhì)對照組：30μl 乳劑基質(zhì)加30μl 脂質(zhì)體，用法同上。 3．結(jié)果

9、治療后15天比較各組治療效果： 移植皮片外觀改變：ASODN組治療后移植皮片紅斑、鱗屑消失，幾乎接近于正常皮膚，而對照組皮損仍保持明顯紅斑，可見白色鱗屑，同治療前相比無明顯改變。各處理組均未見任何不良反應(yīng)。 移植皮片組織病理學(xué)特征：治療組表皮顯著變薄、炎細(xì)胞浸潤減輕、組織學(xué)評分顯著降低；而對照組表皮厚度幾乎保持不變，盡管角化不全消失，部分顆粒層出現(xiàn)，但仍可見角化過度、棘層肥厚、表皮突延長、真皮淺層毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血以及炎

10、細(xì)胞浸潤等銀屑病改變。 RT-PCR結(jié)果：在內(nèi)參照β-肌動蛋白表達(dá)量基本一致的情況下，SODN及乳劑基質(zhì)對照組出現(xiàn)特異的K17基因條帶，而ASODN組K17基因條帶亮度明顯減弱。 免疫組化結(jié)果：ASODN組治療后基底層上方角質(zhì)形成細(xì)胞胞漿染色不明顯，K17陽性細(xì)胞明顯減少；SODN組及乳劑基質(zhì)對照組治療前后K17表達(dá)水平無顯著變化。 三、靶向K17的siRNA對銀屑病SCID小鼠模型的作用 1. siRN

11、A重組質(zhì)粒的制備 K17編碼基因的siRNA表達(dá)質(zhì)粒由本課題組先前構(gòu)建，命名為psilencer3.1/K17，無關(guān)dsRNA對照為psilencer3.1/neg。本實(shí)驗(yàn)采用試劑盒大量提取重組質(zhì)粒，酶切鑒定為正確序列。 2. 分組及給藥 將已構(gòu)建好的動物模型隨機(jī)分為3組，每組4只。分別將K17-siRNA目的質(zhì)粒、對照質(zhì)粒5μl用30μl脂質(zhì)體包裹，使其終濃度為3μg/μl，臨時配制于25μl乳劑基質(zhì)中；乳劑基

12、質(zhì)對照組則僅用乳劑基質(zhì)30μl與脂質(zhì)體30μl混勻；均勻涂抹于移植皮片，間隔2天給藥一次，連續(xù)給藥5次，療程15天。 3. 結(jié)果 靶向K17的siRNA治療后，可見移植皮片紅斑、鱗屑消失；組織病理學(xué)顯示表皮較治療前變薄、炎細(xì)胞浸潤減輕、組織學(xué)評分降低；RT-PCR及免疫組化結(jié)果顯示K17mRNA及蛋白水平下降。而對照質(zhì)粒組及乳劑基質(zhì)對照組移植皮片外觀仍呈明顯紅斑，組織學(xué)顯示表皮較厚，可見角化過度、棘層肥厚，真皮炎細(xì)胞浸潤

13、等改變，K17mRNA及蛋白水平與治療前相比，未見明顯改變。各處理組均未見任何不良反應(yīng)。 本研究將進(jìn)行期斑塊型銀屑病患者的皮損移植于SCID小鼠，并輔以刀豆蛋白A活化的PBMCs刺激，成功構(gòu)建了理想的銀屑病動物模型。在這一基礎(chǔ)上，外用靶向K17－ASODN和siRNA進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)二者均可明顯促進(jìn)SCID小鼠銀屑病樣皮損的恢復(fù)，具有良好的治療效果，不僅明確了K17可以作為治療銀屑病的一個新的藥物作用靶點(diǎn)，而且還為靶向K17的銀屑