慢性腎衰竭大鼠早期脂肪沉積的動態(tài)變化及核心蛋白聚糖基因治療.pdf

1、目的:
　　本研究主要探討早期腎衰竭大鼠主動脈脂肪沉積及血液中脂肪譜濃度變化，及其引發(fā)心血管并發(fā)癥的機制;分子水平闡明核心蛋白聚糖基因治療慢性腎衰竭的療效，以及是否能夠防治并發(fā)的脂質(zhì)代謝紊亂、心血管并發(fā)癥，探討可能的機制。
　　方法:
　　1.實驗動物準備與分組
　　共186只成年SD大鼠，96只雄性，90只雌性，均購自山東大學(xué)實驗室動物中心，體重約150g-200g。在無菌條件下應(yīng)用兩步法，行5/6腎切除手術(shù)制

2、造腎衰竭大鼠模型。假手術(shù)組僅僅切開腹腔，再立即縫合，保留腎臟。兩部分實驗入組大鼠共168只，其余18只根據(jù)需要，同等條件制造相應(yīng)模型，作為意外死亡大鼠的補充。
　　2.相關(guān)指標的檢測
　　2.1第一部分實驗
　　2.1.1實驗分組:
　　實驗組，接受真正的兩步法行5/6腎切除手術(shù)制造腎衰竭大鼠模型，n=24;對照組，僅僅接受手術(shù)切開腹腔皮膚，但保留腎臟，即假手術(shù)組，n=24。分別在第0天、第10天、第30天、第6

3、0天處死6只大鼠，用于取主動脈弓檢測脂肪沉積情況。第40天時不處死，僅抽血。
　　2.1.2血漿、紅細胞膜及主動脈弓脂肪的動態(tài)變化
　　采集檢測第0天、第10天、第20天、第40天和第60天五個時間點的紅細胞膜磷脂的動態(tài)變化。
　　采集檢測第0天、第10天、第30天、第60天血漿甘油三酯、總膽固醇、磷脂的動態(tài)濃度變化，以及主動脈弓脂肪的動態(tài)變化。
　　其中血漿甘油三酯的檢測采用甘油-3-磷酸氧化-苯酚-氨基比林法

4、（PAP法），總膽固醇采用鉬酸銨還原法，紅細胞膜脂肪、主動脈脂肪均先采用Rose-Gottlieb提取法提取出脂肪，其后甘油三酯仍采用PAP法，總膽固醇采用鉬酸銨還原法，磷脂則采用酸消化后，采用鉬藍比色法先檢測出無機磷濃度，在采用無機磷與磷脂的換算系數(shù)計算得出。其他生化指標如血肌酐則采用PAP比率法。
　　2.2第二部分實驗
　　2.2.1實驗分組
　　A組，30只大鼠，行假手術(shù)，保留腎臟;其余均接受真手術(shù)制造腎衰竭大

5、鼠模型。所有大鼠在手術(shù)后均可自由進飲食;等到真手術(shù)組大鼠腎衰竭模型建立成功，則進一步隨機分組，1）B組，手術(shù)對照組，不接受任何治療，n=30;2）C組，空白治療對照組，僅僅接受空白載體轉(zhuǎn)染的成纖維細胞[FB(LXSN)cells]治療，n=30;3）D組，治療組，接受核心蛋白聚糖載體轉(zhuǎn)染的成纖維細胞[FB(LDCNSN)cells]治療，n=30。分別在第0天、第10天、第20天、第30天、第60天每組處死6只大鼠，用于取腎臟組織、主動

6、脈弓。第40天時只抽血，不處死。
　　2.2.2顯微鏡觀察腎臟病理變化
　　觀察第0天、第30天、第60天三個時間點腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化的變化。采用HE、PAS、Masson染色等應(yīng)用普通光鏡觀察腎臟病理變化，采用半定量分級法:0，正常;Ⅰ，腎臟病變（腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化）≤30％;Ⅱ，腎臟病變（腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化）31-60％;Ⅲ，腎臟病變（腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化）≥61％。
　　2.2.3成纖維細胞

7、的培養(yǎng)及注射
　　FB(LDCNSN)和FB(LXSN)細胞均在改良的良伊格爾DMEM細胞培養(yǎng)基（含300ng/ml的G418與10％的胎牛血清）中孵育培養(yǎng)。DCN轉(zhuǎn)染的載體導(dǎo)入FB細胞，培養(yǎng)成FB(LDCNSN)細胞，空白載體導(dǎo)入FB細胞，培養(yǎng)成FB(LXSN)細胞，后應(yīng)用乙二胺四乙酸-胰蛋白酶消化收集，然后應(yīng)用高壓無菌生理鹽水沖洗3次。將細胞濃度調(diào)整到1X106/ml，采用多點注射法注射到腎髓質(zhì)，使之達到約1X106/腎的注射

8、量。
　　2.2.4甘油三酯、總膽固醇、總磷脂、血肌酐、尿素氮的測定
　　均采集檢測第0天、第10天、第20天、第30天和第60天五個時間點的紅細胞膜總膽固醇、總磷脂的動態(tài)變化。
　　均采集檢測第0天、第10天、第20天、第30天、第60天血脂及主動脈弓脂肪的動態(tài)變化。
　　均采集檢測第0天、第10天、第20天、第30天和第60天五個時間點的血肌酐、尿素氮的動態(tài)變化。
　　其中血漿甘油三酯的檢測采用甘油-3

9、-磷酸氧化-苯酚-氨基比林法（PAP法），總膽固醇采用鉬酸銨還原法，紅細胞膜脂肪、主動脈脂肪均先采用Rose-Gottlieb提取法提取出脂肪，其后甘油三酯仍采用PAP法，總膽固醇采用鉬酸銨還原法，磷脂則采用酸消化后，采用鉬藍比色法先檢測出無機磷濃度，在采用無機磷與磷脂的換算系數(shù)計算得出。其他生化指標如血肌酐則采用PAP比率法。
　　2.2.5腎組織中核心蛋白聚糖(DCN)與轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)的檢測
　　檢測第

10、0天、第30天、第60天三個時間點二者在腎組織中表達的動態(tài)變化。EnVisionTM免疫組化系統(tǒng)用于檢測腎組織中的DCN與TGF-β1的表達。
　　具體過程:脫蠟、微波修復(fù)抗原10min、每個玻片加1滴3％雙氧水、室溫孵育20min、加一抗(兔抗鼠單克隆抗TGF-β1抗體、兔抗鼠單克隆抗DCN)、1∶200稀釋、室溫孵育2h，磷酸緩沖鹽水(PBS)漂洗5minX3次、加抗生物素蛋白、室溫孵育20min、PBS漂洗3min、加辣根過

11、氧化物酶標記的山羊抗兔二抗，、室溫孵育30min、PBS漂洗5minX3次、加3，3'-二氨基聯(lián)苯胺、光鏡觀察5min、加用蘇木精復(fù)染和01.％鹽酸保存、流動水水沖洗、顯藍色、乙醇梯度脫水、加二甲苯、樹膠封片、空氣風干。
　　觀察DCN與TGF-β1的表達，采用半定量觀察其分布法:0，沒有染色;1，偶然有染色;2，局灶性染色;3，彌漫性染色。
　　3.統(tǒng)計分析
　　采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析，計量數(shù)值以x±s表示

12、，根據(jù)需要選用配對資料的t檢驗或單因素方差分析及線性相關(guān)分析進行統(tǒng)計分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.第一部分實驗結(jié)果
　　實驗組BUN和Scr濃度在第10天達到最高(分別為26.56±2.16 mmol/l和308.50±15.73μmol/l)。濃度在第20天開始下降，第40天值最低（分別為16.22±3.57mmol/l和193.45±20.32μmol/l）;不過，這兩個時間點的濃度都

13、比對照組的要高（分別為7.89±2.58 mmol/l和91.22±19.73μmol/l）(P＜0.01)。BUN和Scr濃度在第60天再次升高。
　　實驗組主動脈弓三種脂肪成分甘油三酯、總膽固醇、磷脂均在第10天時呈現(xiàn)上升趨勢，甘油三酯在第30天、60天時明顯高于對照組(P＜0.05，P＜0.01)。總膽固醇、總磷脂在第10天時開始升高，在第60天時明顯高于對照組(P＜0.01，P＜0.05)。血漿TG和T-Ch水平與主動脈組

14、織中相應(yīng)脂質(zhì)水平顯著正相關(guān)(r=0.944和r=0.937)，而血漿T-PL水平剛與主動脈組織中T-PL水平顯著負相關(guān)(r=-0.832)。
　　實驗組血漿中甘油三酯、總膽固醇均在第10天開始升高，并持續(xù)升高，在第10天、第30天、第40天、第60天時均高于對照組(P＜0.05)?？偭字诘?0天時明顯升高，然后在第20天、30天時降低，在第60天時復(fù)又開始輕度升高。
　　實驗組紅細胞膜總膽固醇在第10天開始升高，在第40天

15、、60天時明顯高于對照組(P＜0.05)，紅細胞膜總磷脂在第20天時較對照組輕度降低(P＜0.05)，在第40天、60天時則較對照組明顯降低(P＜0.01)。紅細胞膜中T-Ch的水平與血漿T-Ch水平顯著正相關(guān)(r=0.946)。
　　2.第二部分實驗結(jié)果
　　采用核心蛋白聚糖治療干預(yù)后，D組在第10天之后的各時間點血尿素氮、血肌酐均較B組與C組上升幅度明顯變小(P＜0.05)，但仍較A組上升(P＜0.05)。D組在第30天

16、和第60天DCN在腎組織中表達較B組、C組均明顯增加(P＜0.01)。D組中TGF-β1表達在第30天和第60天則較B、C組均有所減少(P＜0.05)，但仍較A組仍明顯增加(P＜0.05)，B組、C組與本組第0天及A組比較亦明顯增加(P＜0.01)
　　采用核心蛋白聚糖治療干預(yù)后，D組在第30天、60天血脂成分升高幅度均低于B組與C組(P＜0.01)，亦較A組升高，差異程度小于與B組及C組的差異(P＜0.05)，主動脈弓血脂變化與

17、血脂類似，D組紅細胞膜總膽固醇在第20天開始升高，在第30天、60天明顯升高，但升高幅度均小于B組與C組(P＜0.05)，磷脂則在第20天開始降低，第30天、60天時明顯降低，降低幅度亦明顯小于B組與C組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　早期慢性腎衰竭大鼠血脂升高，主動脈脂肪沉積增加，發(fā)生動脈粥樣硬化風險增加。紅細胞膜膽固醇增加，磷脂降低，膜的僵硬程度增加，變形能力變差。
　　應(yīng)用核心蛋白聚糖基因治療后，不但能延緩腎