急性腎衰竭大鼠血小板功能變化及機制研究.pdf

1、本文從以下幾方面進行論述：
　　第一部分：急性腎衰竭大鼠模型的建立。
　　目的：
　　急性腎功能衰竭(acute renal failure, ARF)經(jīng)常是地震、交通事故、礦難等重大災(zāi)難中人員死亡的主要原因之一。在這些事件中身體因受到嚴(yán)重碾壓、重傷而引發(fā)擠壓綜合征，其中特別是以急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)為主并一系列與之相關(guān)的并發(fā)癥最終導(dǎo)致了ARF的發(fā)生。到目前急性腎功能衰竭(ARF)

2、的病死率仍然高達(dá)50％左右。如果可以讓橫紋肌溶解所致急性腎衰竭的發(fā)生率得到控制或降低，對大眾健康和社會將會意義重大。本實驗該部分首先建立并評估甘油導(dǎo)致急性腎衰模型，為后續(xù)實驗做準(zhǔn)備。
　　方法：
　　模型組和對照組大鼠禁水24 h，期間不禁食，稱重后于后二肢肌肉等量注射甘油生理鹽水溶液（10ml/kg），正常組大鼠注射生理鹽水溶液（10ml/kg），造模后72h取大鼠血漿，檢測血漿Cr、BUN、P、K水平，并取大鼠腎臟做HE

3、染色分析。
　　結(jié)果：
　　和對照組比，模型組大鼠血漿中Cr、BUN、P、K水平明顯增高，且腎組織切片HE染色提示模型組大鼠腎臟發(fā)生明顯的病理性損傷。
　　結(jié)論：
　　甘油生理鹽水注射制作大鼠ARF模型可以引起其腎臟功能的急性下降，快速引起腎臟實質(zhì)性損傷，模型制備成功。
　　第二部分：急性腎衰竭大鼠血小板功能變化研究。
　　目的：
　　橫紋肌溶解引起的肌紅蛋白毒型的急性腎衰竭（Acute ren

4、al failure，ARF）占該病病例的10-40%，其中急性腎衰患者凝血功能出現(xiàn)顯著性變化，一方面患者傾向于出現(xiàn)出血事件，另一方面又伴隨著血栓性事件頻發(fā)。血小板是凝血系統(tǒng)中一個重要角色，在生理性止血和病理性血栓過程中都是積極參與者，該實驗研究了大鼠發(fā)生橫紋肌溶解所致急性腎衰竭過程中血小板體外活性變化，旨在探索急性腎衰時血小板功能的變化情況。
　　方法：
　　1.血細(xì)胞計數(shù)儀檢測ARF和正常組大鼠全血中血小板數(shù)目差異。

5、r>　　2.用血小板聚集儀比較模型組和正常組血小板在低高劑量激動劑：ADP、Collagen、CRP和Thrombin刺激下聚集活性的區(qū)別。
　　3.用血小板聚集檢測儀檢測兩組血小板在Collagen(1μg/ ml)誘導(dǎo)下ATP釋放的差異。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)檢測兩組血小板在靜息和激動（Thrombin,0.1U/ml）狀態(tài)下P-selectin（CD62P）表達(dá)的差異。
　　結(jié)果：
　　1.在急性腎衰竭情況下

6、大鼠全血中血小板數(shù)目和正常組相比沒有發(fā)生顯著性改變。
　　2.在激動劑Collagen、CRP、Thrombin的低劑量激動劑刺激下模型組洗滌血小板聚集能力明顯強于對照組，而高劑量下沒有區(qū)別；在低高劑量ADP刺激下模型組PRP（platelet-rich plasma）聚集能力均高于對照組且有顯著性差異；且由Collagen引起的兩組洗滌血小板的ATP釋放也存在顯著性差異。
　　3.在Thrombin刺激下，流式細(xì)胞術(shù)檢測到

7、兩組血小板在激動前后其P-selectin表達(dá)并不存在顯著性差異。
　　結(jié)論：
　　大鼠在急性腎衰竭情況下，大鼠血小板聚集和釋放致密顆粒的能力均比正常組強，而釋放α-顆粒的能力沒有改變；
　　第三部分：大鼠急性腎衰時血小板活性變化機制研究。
　　目的：
　　研究大鼠發(fā)生ARF時血小板功能變化情況下，血小板表面受體表達(dá)及胞內(nèi)信號蛋白分子磷酸化水平相對于正常對照組的改變情況，探索其功能變化機制。
　　方法

8、：
　　制取ARF和正常組大鼠洗滌血小板，用Collagen(2μg/mL)刺激血小板活化，選擇在0s、90s、180s時將其裂解，采用Western blot技術(shù)檢測兩組血小板膜GPⅥ表達(dá)水平及胞內(nèi)蛋白 PKC底物（p47）、AKT（Ser473）、ERK1/2(E4)磷酸化水平，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測在Thrombin（0.1U/ml）刺激前后兩組血小板表面受體GPⅢa（CD61）的水平差異。
　　結(jié)果：
　　West

9、ern bloting結(jié)果顯示在刺激0s、90s、180s時，模型組血小板其表面GPⅥ水平和胞內(nèi) PKC底物（p47）、AKT（Ser473）、ERK1/2(E4)信號蛋白磷酸化水平均較正常組顯著增高，同時流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明模型組血小板在靜息和激動狀態(tài)下GPⅢa（CD61）表達(dá)水平也顯著性增高。
　　結(jié)論：
　　大鼠急性腎衰時其血小板活性增高的原因可能與表面受體GPⅥ和GPⅢa的表達(dá)上調(diào)及下游信號蛋白分子磷酸化水平增高有