青霉素G誘導(dǎo)的Cps持續(xù)性感染對相關(guān)基因表達(dá)及宿主細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的：
　　建立鸚鵡熱嗜衣原體（Chlamydophila psittaci，Cps）持續(xù)性感染人子宮頸癌上皮細(xì)胞（HeLa細(xì)胞）的體外研究模型，分析Cps持續(xù)性感染對Cps相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平及宿主細(xì)胞凋亡的影響，初步探討Cps持續(xù)性感染的分子機制。
　　方法：
　　在MOI為2的Cps感染體外培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞2h之后，更換含有不同濃度青霉素G的新鮮衣原體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48h，通過間接免疫熒光染色法對Cp

2、s的感染能力進(jìn)行分析，確定青霉素G誘導(dǎo)Cps持續(xù)性感染的最佳誘導(dǎo)濃度。在青霉素G誘導(dǎo)Cps持續(xù)性感染24h或48h之后，分別采用免疫熒光染色技術(shù)和透射電子顯微鏡計數(shù)檢測包涵體的形態(tài)學(xué)變化特征，并研究去除青霉素G后， Cps重新恢復(fù)其感染性的能力。從Cps全基因序列中挑選10個與Cps的復(fù)制、分裂、代謝、膜結(jié)構(gòu)等相關(guān)的基因（DnaA、DnaK、FtsW、FtsY、GrpE、RpsD、IncC、OmcB、CPSIT_0846、CPSIT_0

3、042），采用實時定量RT-PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測持續(xù)性Cps感染期間衣原體基因的mRNA在不同時間點（6h、12h、24h、48h、72h）的表達(dá)水平差異。16S rRNA作為內(nèi)參基因。另外，在青霉素G誘導(dǎo)Cps的持續(xù)性感染24h之后，用1μM凋亡誘導(dǎo)劑 Staurosporine和溶媒對照處理細(xì)胞4h，并采用DNA Ladder法、AO/EB染色、Hoechst33258染色，以及流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞的凋亡水平進(jìn)行分析。

4、>　　結(jié)果：
　?。?）用青霉素G處理Cps感染的細(xì)胞，可誘導(dǎo)Cps出現(xiàn)持續(xù)性感染，其最佳青霉素G誘導(dǎo)濃度為100U/mL。
　?。?）持續(xù)性感染狀態(tài)下，Cps的包涵體形態(tài)特征較急性感染明顯不同。在急性感染組中，Cps包涵體較大且形態(tài)多樣，包涵體內(nèi)存在大量致密的EB顆粒和少量RB顆粒；而持續(xù)性感染組，衣原體的包涵體偏小且外形偏圓，包涵體內(nèi)的EB顆粒少見或不見，并出現(xiàn)部分異常膨脹變大的RB顆粒;去除青霉素G后，Cps可部分恢復(fù)

5、其感染性。
　?。?）與Cps急性感染相比較，在持續(xù)性感染狀態(tài)下Cps基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了改變：FtsW、FtsY和CPSIT_0042等基因的mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)（P值<0.01）， DnaA、DnaK、GrpE、RpsD、IncC和CPSIT_0846等基因轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)（P值<0.05），而OmcB等基因的轉(zhuǎn)錄水平幾乎沒有發(fā)生明顯變化（P值>0.05）。
　　（4）在凋亡誘導(dǎo)劑Staurosporine處理下，

6、Cps持續(xù)性感染細(xì)胞的的凋亡率明顯低于未感染細(xì)胞（P值<0.01），但高于Cps急性感染的細(xì)胞（P值<0.05）。
　　結(jié)論：
　?。?）成功構(gòu)建了由青霉素G誘導(dǎo)的Cps持續(xù)性感染的體外細(xì)胞模型。
　?。?）持續(xù)性感染期間，Cps基因DnaA、DnaK、GrpE、RpsD、IncC、CPSIT_0846、FtsW、FtsY、CPSIT_0042等的mRNA表達(dá)水平發(fā)生了明顯的變化，這可能與Cps持續(xù)性感染期間包涵體的形