鸚鵡熱嗜衣原體急性感染與持續(xù)性感染差異表達基因篩選.pdf

1、[目的]基因芯片檢測鸚鵡熱嗜衣原體（Chlamydophila psittaci，Cps）急性感染與持續(xù)性感染的差異表達基因，篩選與Cps6BC持續(xù)性感染有關(guān)的關(guān)鍵基因，探討Cps持續(xù)性感染發(fā)生的可能分子機制。
　　[方法]1.Cps6BC誘導細胞的急性感染：用Cps6BC標準株感染HeLa細胞，培養(yǎng)2h后從培養(yǎng)箱中取出，吸棄感染液，更換為DMEM+10％FBS，37℃培養(yǎng)。2.Cps6BC誘導細胞的持續(xù)性感染：用 Cps6BC標

2、準株感染 HeLa細胞，并在感染液中加入35ng/mL rhIFN-γ，培養(yǎng)2h后從培養(yǎng)箱中取出，吸棄感染液，更換為含35ng/mL rhIFN-γ的衣原體生長培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)。3.分別收集6、12、24、36、48、60h Cps6BC急性感染與持續(xù)性感染的HeLa細胞，提取CpsRNA后，采用Agilent8×15KCps全基因組表達譜芯片檢測、比較分析急性感染與持續(xù)性感染中 Cps的差異表達基因，然后用Absolute Fold

3、 change≥2為顯著上調(diào)，F(xiàn)old change≤0.5為顯著下調(diào)，同時Flag標記為Detected的標準進行差異基因篩選，運用GO分類、KEGG代謝通路及DAVID在線軟件對差異基因進行功能聚類及通路分析，并通過Realtime-PCR確證部分差異基因。
　　[結(jié)果]通過比較Cps急性感染與持續(xù)性感染，發(fā)現(xiàn)在12~60h共有持續(xù)性感染差異表達基因287個，包括74個表達上調(diào)基因，以及213個表達下調(diào)基因，GO分類的BP分析

4、顯示，21個持續(xù)性感染表達上調(diào)基因參與1個與翻譯相關(guān)的BP分類“translation”，EASE score為3.58E-09，58個持續(xù)性感染表達下調(diào)基因參與8個BP分類，其中能量代謝相關(guān)的“oxidation reduction”、參與氨基酸合成及代謝的“tetrapyrrole biosynthetic process”、“tetrapyrrole metabolic process”EASE Score最低，小于0.03。57

5、個持續(xù)性感染表達上調(diào)基因參與4個MF分類,“structural molecule activity”、“structure constituent of ribosome”、“rRNA binding”ESAEScore較低，小于9.6E-6。41個持續(xù)性感染表達下調(diào)基因參與8個MF分類，主要涉及核苷酸及無機離子轉(zhuǎn)運等，其中“nucleotidyltransferase activity”、“sodiumion binding”、“o

6、xidoreductase activity”的EASE Score最低，小于0.03。利用KEGG pathway分析顯示，當EASE Score＜0.1時，有18個持續(xù)性感染表達上調(diào)基因參與了1條“KEGG-pathway”；38個持續(xù)性感染表達下調(diào)基因參與了5條“KEGG-pathway”。將持續(xù)性感染差異表達基因涉及的生物學功能進行“Functional Annotation Clustering”分析，結(jié)果顯示持續(xù)性感染表達上

7、調(diào)基因涉及的生物學功能分類聚成4個集合，其中Enrichment Score最高的功能集合與rRNA的合成相關(guān)。持續(xù)性感染表達下調(diào)基因涉及的生物學功能分類聚成23個集合，其中Enrichment Score最高的功能集合與某些生物合成及代謝相關(guān)。Real time-PCR檢測目的基因CPSIT_0739（6h）、CPSIT_0043（12h）、CPSIT_0531（36h）、 CPSIT_0555（48h）的mRNA表達水平，結(jié)果均與芯