預(yù)測(cè)的鸚鵡熱嗜衣原體T3SS效應(yīng)蛋白的定位、免疫原性及表達(dá)特性初步研究.pdf

1、目的
　　預(yù)測(cè)鸚鵡熱嗜衣原體（Chlamydophila psittaci，Cps）III型分泌系統(tǒng)(Type III secretion system，T3SS)效應(yīng)蛋白編碼基因，研究預(yù)測(cè)蛋白在感染細(xì)胞中的定位、免疫原性及其在感染細(xì)胞中的表達(dá)時(shí)相，為進(jìn)一步研究其結(jié)構(gòu)與功能奠定基礎(chǔ)。
　　方法
　　用計(jì)算機(jī)輔助的生物信息學(xué)方法Effective T3、BPBAac tool，以及根據(jù)其他文獻(xiàn)資料，預(yù)測(cè)Cps T3SS效

2、應(yīng)蛋白編碼基因。提取Cps6BC菌株DNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物，PCR擴(kuò)增預(yù)測(cè)Cps T3SS效應(yīng)蛋白編碼基因，酶切后連接到載體pGEX-6P-1，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-6P-1/目的片段，經(jīng)PCR、測(cè)序鑒定后將其轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌E.coli BL21中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。Western blot分析和鑒定表達(dá)產(chǎn)物；對(duì)溫度、IPTG濃度和時(shí)間等誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行系列的優(yōu)化后，獲得可溶性表達(dá)蛋白并大量誘導(dǎo)表達(dá)。GST樹(shù)脂純化重組蛋白，BC

3、A法測(cè)定蛋白濃度；將重組蛋白經(jīng)皮下注入免疫BALB/c小鼠，ELISA法檢測(cè)免疫小鼠血清中重組蛋白多克隆抗體的效價(jià)，以評(píng)價(jià)這些蛋白的免疫原性；并以制備的多克隆抗體為一抗，應(yīng)用間接免疫熒光檢測(cè)預(yù)測(cè)蛋白在感染細(xì)胞中的定位。在Cps感染后2、8、24、48h后，用Western blot檢測(cè)這些蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果
　　應(yīng)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)了5個(gè)可能的Cps T3SS效應(yīng)蛋白編碼基因：CPSIT_0930、CPSIT_07

4、67、CPSIT_0749、CPSIT_0580、CPSIT_0420。PCR擴(kuò)增得到其目的片段；構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng) PCR和測(cè)序證實(shí)插入片段為目的基因，測(cè)序結(jié)果與Genbank上登錄序列完全一致；SDS-PAGE結(jié)果顯示，在IPTG誘導(dǎo)下，對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行系列的優(yōu)化后，分別表達(dá)了相對(duì)分子量（Mr）與預(yù)測(cè)分子量相近的可溶性蛋白。重組蛋白經(jīng)GST樹(shù)脂純化后，免疫雌性BALB/c小鼠，收集血清，抗CPSIT_0930、CPSIT_0767、

5、CPSIT_0749抗體效價(jià)為1:16000，抗CPSIT_0580、CPSIT_0420效價(jià)為1:8000。IFA進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位發(fā)現(xiàn)CPSIT_0930、CPSIT_0767、CPSIT_0749、CPSIT_0580、CPSIT_0420均定位于包涵體內(nèi)。除CPSIT_0767在Cps感染后48h才開(kāi)始表達(dá)外，其余蛋白均在感染后2h開(kāi)始表達(dá)，8h后表達(dá)停止。
　　結(jié)論
　　1. CPSIT_0930、CPSIT_0767