鸚鵡熱嗜衣原體Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白的預(yù)測、鑒定及特性的研究.pdf

1、目的：預(yù)測、篩選鸚鵡熱嗜衣原體（Chlamydophila psittaci, Cps）III型分泌系統(tǒng)(Type III secretion system, T3SS)效應(yīng)蛋白，研究其細(xì)胞內(nèi)定位和特征。
　　方法：計(jì)算機(jī)輔助的生物信息學(xué)方法Effective T3、BPBAac tool，以及其他T3SS效應(yīng)蛋白文獻(xiàn)資料，預(yù)測Cps T3SS效應(yīng)蛋白編碼基因。提取Cps6BC菌株DNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物，PCR擴(kuò)增Cps T

2、3SS假設(shè)效應(yīng)蛋白編碼基因，酶切后連接到載體pGEX-6P-1上，亞克隆構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-6P-1/目的片段，經(jīng)PCR、測序鑒定后轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌E.coli BL21中，并進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。對(duì)溫度、IPTG濃度和時(shí)間等誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行系列優(yōu)化后獲得可溶性表達(dá)蛋白，并大量誘導(dǎo)表達(dá)，Western blot分析和鑒定表達(dá)產(chǎn)物。GST樹脂純化重組蛋白，BCA法測定蛋白濃度；重組蛋白皮下免疫BALB/c小鼠，檢測免疫小鼠血清中重組蛋白

3、多克隆抗體的效價(jià)，并以制備的多克隆抗體為一抗，應(yīng)用間接免疫熒光（Immunofluorescence assay, IFA）檢測假設(shè)效應(yīng)蛋白在感染細(xì)胞的定位情況，以篩選Cps效應(yīng)蛋白。對(duì)篩選出來的效應(yīng)蛋白，監(jiān)測其在不同時(shí)間點(diǎn)的分泌情況，并用RT-PCR和Western blot分析其轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)時(shí)相。此外，Western blot分析效應(yīng)蛋白與其他衣原體的血清的交叉反應(yīng)。ELISA法檢測效應(yīng)蛋白刺激THP-1細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β、IL-

4、6和TNF-α的情況。
　　結(jié)果：應(yīng)用Effective T3、BPBAac tool交叉驗(yàn)證，預(yù)測了9個(gè)Cps T3SS效應(yīng)蛋白編碼基因：CPSIT_0357、CPSIT_0429、CPSIT_0461、CPSIT_0463、CPSIT_0490、CPSIT_0594、CPSIT_0785、CPSIT_0844、CPSIT_0846，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，選取了CPSIT_0019、CPSIT_0020、CPSIT_0968、CPSI

5、T_0969、CPSIT_0942。培養(yǎng)Cps6BC48h后提取DNA，擴(kuò)增得到其目的片段；構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和測序證實(shí)插入片段為目的基因，測序結(jié)果與Genbank上登錄序列完全一致；SDS-PAGE結(jié)果顯示，在IPTG誘導(dǎo)下，對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行系列的優(yōu)化后，除 CPSIT_0357、 CPSIT_0429、CPSIT_0968、CPSIT_0969外，重組菌分別表達(dá)了相對(duì)分子量（Mr）與預(yù)測分子量相近的可溶性蛋白。經(jīng)GST樹脂純化

6、后，將重組蛋白免疫雌性 BALB/c小鼠，收集血清，檢測其抗體效價(jià)：CPSIT_0785、CPSIT_0844、CPSIT_0846、CPSIT_0019、CPSIT_0020效價(jià)高達(dá)1:64000。IFA細(xì)胞內(nèi)定位觀察中，CPSIT_0844和CPSIT_0846位于包涵體膜，而CPSIT_0461、CPSIT_0463、CPSIT_0490、CPSIT_0594、CPSIT_0785、CPSIT_0019、CPSIT_0020、CP

7、SIT_0942位于包涵體內(nèi)。CPSIT_0844、CPSIT_0846在Cps感染后0、6、12、18、24h后進(jìn)行IFA監(jiān)測，18h能觀察到分泌于包涵體膜，并在隨后的整個(gè)感染周期中位于包涵體膜。感染后2h即可在RT-PCR中檢測到CPSIT_0846的mRNA的轉(zhuǎn)錄，而CPSIT_0844在12h檢測到其轉(zhuǎn)錄，Western blot也顯示了相同的結(jié)果，并隨感染的時(shí)間而遞增。CPSIT_0844、CPSIT_0846與Cps抗血清在

8、相應(yīng)條帶有反應(yīng)，而與肺炎嗜衣原體(Chlamydia pneumoniae，Cpn)和沙眼衣原體（Chlamydia trachomati， Ct）抗血清無交叉反應(yīng)。CPSIT_0844、CPSIT_0846能誘導(dǎo) THP-1細(xì)胞表達(dá)IL-1β、IL-6和TNF-α。
　　結(jié)論：
　　1. Effective T3、BPBAac tool信息學(xué)篩選T3SS效應(yīng)蛋白，結(jié)合顯微鏡定位分析，對(duì)T3SS的研究具有指導(dǎo)性意義。

9、　　2. CPSIT_0844、CPSIT_0846位于包涵體膜，而 CPSIT_0461、CPSIT_0463、CPSIT_0490、CPSIT_0594、CPSIT_0785、CPSIT_0019、CPSIT_0020、CPSIT_0942主要位于包涵體內(nèi)。
　　3. CPSIT_0844、CPSIT_0846作為效應(yīng)蛋白，在感染中期和早期發(fā)揮了一定的作用，體外能誘導(dǎo) THP-1細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子。CPSIT_0844、CPSI