內(nèi)毒素誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB-Jmjd3信號(hào)軸下游基因表達(dá)的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制.pdf

1、目的：
　　慢性炎癥與腫瘤關(guān)系密切，血管內(nèi)皮細(xì)胞在炎癥和腫瘤的病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究以內(nèi)毒素（LPS）激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，釋放炎癥介質(zhì)和粘附分子，探索內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB- Jmjd3信號(hào)軸在內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)過(guò)程的的作用，并分析其可能的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制，為有效抑制血管炎癥反應(yīng)，尋找相關(guān)疾病治療靶點(diǎn)，提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)及分組：復(fù)蘇并常規(guī)培養(yǎng)原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs），隨機(jī)分為對(duì)照

2、組與LPS實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組按照不同檢測(cè)指標(biāo)要求，予LPS刺激不同時(shí)間段后取樣待測(cè)。
　　2、LPS誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎性介質(zhì)和粘附分子的表達(dá)釋放：ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-6、MMP-9和ICAM-1與表達(dá)變化；
　　3、NF-κB/p65、Jmjd3的表達(dá)與定位:免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察NF-κB/p65、Jmjd3的表達(dá)與定位變化；RT-PCR檢測(cè)Jmjd3 RNA水平的表達(dá)變化；蛋白質(zhì)免疫印跡法驗(yàn)證NF-κB/p65，Iκ

3、Bα和Jmjd3的表達(dá)變化；
　　4、NF-κB/p65轉(zhuǎn)錄因子活性測(cè)定：Millipore轉(zhuǎn)錄因子試劑盒檢測(cè)胞核NF-κB/p65蛋白活性；
　　5、染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)分析目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄起始結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域NF-κB/p65、Jmjd3、H3K27me3的募集關(guān)系：應(yīng)用Millipore染色質(zhì)免疫共沉淀試劑盒建立目標(biāo)DNA文庫(kù)，ChIP-qPCR分析在目標(biāo)基因IL-6、MMP-9和ICAM-1轉(zhuǎn)錄起始結(jié)合位點(diǎn)NF-κB/p6

4、5、Jmjd3、H3K27me3的募集關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1、LPS誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎性介質(zhì)和粘附分子的表達(dá)釋放：細(xì)胞上清液中IL-6、MMP-9和ICAM-1分別與相應(yīng)的對(duì)照組相比表達(dá)顯著升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　2、NF-κB-Jmjd3信號(hào)通路的活化：
　?。?）NF-κB/p65免疫熒光實(shí)驗(yàn)中LPS各組與空白對(duì)照組（0h組）相比，隨著刺激時(shí)間增加整體熒光強(qiáng)度逐漸增加，NF-κB/p

5、65表達(dá)上調(diào)，并逐漸向轉(zhuǎn)胞核內(nèi)聚集，核轉(zhuǎn)位高峰為2 h。
　?。?）NF-κB/p65轉(zhuǎn)錄因子活性測(cè)定：LPS刺激2h組中NF-κB/p65蛋白相對(duì)活性顯著高于對(duì)照組（0h組）（P<0.01），余各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異（P>0.05)。
　　（3）RT-PCR檢測(cè)Jmjd3 RNA水平變化：LPS2h組RNA水平顯著高于對(duì)照組（0h組），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，余各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異（P>0.

6、05)。
　?。?）Jmjd3免疫熒光實(shí)驗(yàn)中LPS各組與對(duì)照組（0h組）相比Jmjd3的表達(dá)均上調(diào)，其中于1h和2h上調(diào)明顯。
　?。?）蛋白質(zhì)免疫印跡法驗(yàn)證總NF-κB/p65蛋白隨著LPS刺激時(shí)間增加表達(dá)逐漸上調(diào)；胞核NF-κB/p65蛋白于2h和6h表達(dá)明顯上調(diào)；IκBα蛋白于LPS2h和4h組表達(dá)明顯下調(diào)；Jmjd3表達(dá)亦上調(diào)，于1h和2h上調(diào)明顯。
　　（6）染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)分析目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄起始結(jié)合位點(diǎn)

7、NF-κB/p65、Jmjd3和H3K27me3的募集關(guān)系：NF-κB/p65關(guān)聯(lián)DNA文庫(kù)中IL-6、MMP-9的相對(duì)擴(kuò)增量與相應(yīng)的對(duì)照組相比顯著升高（P<0.01），而 ICAM-1與相應(yīng)對(duì)照組相比升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；Jmjd3關(guān)聯(lián)DNA文庫(kù)、H3K27me3關(guān)聯(lián)DNA文庫(kù)中目標(biāo)基因擴(kuò)增結(jié)果與NF-κB/p65關(guān)聯(lián)DNA文庫(kù)擴(kuò)增結(jié)果一致。結(jié)論：
　　LPS誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中NF-κB-Jmjd3信號(hào)通路激活，