強的松與促皮質素藥物致嬰幼期腦損傷的實驗性研究.pdf

1、第一部分、治療劑量范圍內強的松與ACTH大鼠用藥模型建立。 目的：建立在臨床治療劑量范圍內強的松與ACTH的嬰幼大鼠實驗模型。 方法：將強的松或ACTH對HPA軸的影響程度作為劑量探索的原則。 ①強的松劑量的確認：采集lO例臨床使用5天以上治療劑量強的松患兒清晨血清標本，獲得用藥后平均皮質醇血濃度。再以體表面積公式換算，將24只7日齡雄性SD嬰幼鼠分為：2mg/kg/d、3mg/kg/d和4mg/kg/d給藥組，

2、以及正常對照組(n=6)共4組。每日清晨8點一次性灌胃給藥，連續(xù)7日，第8日清晨8點麻醉后取血，測血清皮質酮濃度。 ②ACTH劑量的確認：60只14日齡雄性嬰幼鼠，根據給藥劑量和時間分為9個實驗組和1個對照組(n=6)。實驗組麻醉后在三個時間點(2 pm，3 pm，3:30pm)，以大小相差40倍的3個劑量(3.8U/m2，38 U/m2，150 U/m2)分別腹腔注射ACTH一次；對照組僅麻醉不給予其他干預。4pm取血測皮質酮

3、濃度。 結果： ①強的松劑量的確認：10名患兒血清平均皮質醇濃度為87.18±39.71 nmol/L，其均值為正常兒童均值(552nmol/L)的15.79％。 ②當強的松劑量為4mg/kg/d時，大鼠皮質酮濃度降低至對照組的15.17％，與臨床患兒皮質醇抑制程度相一致。③在腹腔注射大小相差40倍的不同劑量ACTH后30分鐘時，嬰幼鼠皮質酮水平均升高達到同一峰值，60分鐘時開始下降，120分鐘時各劑量組皮質酮水

4、平均回落至基礎值，與對照組無顯著差異。 結論： ①4mg/kg/d連續(xù)7日給藥后，嬰幼鼠血清皮質酮濃度被抑制為正常的15％左右，與臨床測試相一致，因而被確認為本研究強的松實驗劑量。 ②與人類研究相一致，注射ACTH30分鐘后，大鼠體內皮質酮增高程度不隨ACTH劑量變化而顯示差異。因而將臨床嬰兒痙攣治療劑量按照體表面積直接換算，構建與臨床治療劑量匹配的ACTH實驗大鼠模型。 第二部分、強的松與ACTH致嬰幼

5、期腦損傷的組織學研究。 目的：以健康大鼠為對照，觀察不同療程和劑量的強的松與ACTH對生后早期嬰幼鼠腦發(fā)育的組織病理學影響。 方法：7日齡嬰幼期和2月齡成年健康SD雄性大鼠各192只，分別給予：(1)強的松組：兩年齡組各96只，分為治療劑量組(4mg/kg/d)、小劑量組(2mg/kg/d)和對照組(賦形劑0.5％CMC)，清晨一次灌胃給藥； (2)ACTH組：同樣分為治療劑量組(150U/m2/d)、小劑量組(38U/

6、m2/d)和對照組(生理鹽水)，每日劑量分兩次腹腔注射給藥。每一劑量組(n=32)又分為長療程組(3周)(n=16)和短療程組(10天)(n=16)。分別在完成預定療程后次日清晨(n=8)和停藥4周后(n=8)留取標本，記錄體重、腦重，測血清皮質酮濃度，對額葉皮層及海馬切片行HE及尼氏染色，透射電鏡觀察海馬超微結構。 結果： ①嬰幼鼠短程治療劑量強的松組血清皮質酮抑制程度為對照組的10.75％，短程治療劑量ACTH組血清

7、皮質酮升高程度為對照組的1.83倍，與第一部分的劑量預測基本一致，表明模型建立成功。 ②短程強的松或ACTH均導致嬰幼鼠及成年鼠體重顯著降低，與對照相比降低幅度在7.9～17.5％間，劑量愈大降低愈明顯。停藥4周后，兩年齡組的體重有不同程度恢復，但仍低于對照。長程給藥對體重的抑制更為明顯，對嬰幼鼠體重的抑制程度達20.6～37.7％。停藥4周后，兩年齡鼠體重均值仍較對照低9.8～23.5％。 ③嬰幼鼠用藥后發(fā)生明顯腦重下

8、降。短程用藥后兩藥致嬰幼鼠腦重降低的幅度在5.3～10.7％間，降低幅度與劑量相關。停藥4周后強的松組己基本恢復正常，唯ACTH組腦重仍較對照組減低近20％。長程用藥后嬰幼鼠強的松組抑制幅度與短程相似，ACTH組抑制幅度高達11.7～15.9％。長程給藥對成年鼠腦重也有輕度影響，抑制幅度2.2％～4.8％間。停藥4周后，成年鼠腦重與對照不再有差距，但嬰幼鼠兩藥治療劑量組腦重仍較對照分別減低4.1％和13.2％(P＜0.01)。

9、④HE染色發(fā)現，兩藥短程治療劑量與長程兩劑量的嬰幼鼠，以及長程治療劑量成年鼠均可見明顯的神經細胞變性及壞死，停藥4周后均未再見明顯組織學病變。 ⑤尼氏染色發(fā)現，嬰幼鼠在兩藥物的短程和長程治療劑量，以及長程小劑量給藥時，均可見額葉皮層及海馬神經細胞尼氏體減少、溶解消失現象，額葉皮層神經細胞計數較對照組明顯減少，分別達25.9％～32.1％(強的松)和24.4％～29.1％(ACTH)間。停藥4周后，神經細胞病變不再明顯，但無論短程

10、或長程用藥，治療劑量ACTH嬰幼鼠神經細胞計數仍低于同齡對照15.8％～20.3％。無論短程或長程用藥，兩藥均未引起成年鼠額葉皮層神經細胞形態(tài)及數量的明顯異常，但在長程治療劑量時可見海馬神經細胞有尼氏體減少、溶解消失現象，停藥4周后，病變不再明顯。 ⑥透射電鏡發(fā)現病變海馬神經細胞染色質邊集，濃縮成塊狀，內質網擴張，線粒體腫脹，血管周圍水腫。并見髓鞘溶解變性及分層現象。停藥4周后超微結構基本恢復正常。 結論： ①強

11、的松與ACTH均會引起嬰幼鼠和成年鼠體重明顯降低。 ②強的松與.ACTH對嬰幼鼠和成年鼠腦組織均有損傷作用，但嬰幼鼠更敏感。停藥4周后，額葉皮層神經細胞數量仍然減少，表明激素，尤其ACTH對嬰幼鼠腦組織可能造成持久性損傷。 ③強的松與ACTH對細胞數量的減少與腦重的降低并不平行，提示腦重的降低不僅由細胞數量減少引起，還可能涉及其他機制的作用。 目的：初步探討強的松與ACTH導致腦損傷的機理。 方法：實驗動

12、物及分組同第二部分。ELISA檢測血清NSE，免疫組化檢測額葉和海馬皮層Bcl-2、Bax蛋白表達，TUNEL檢測凋亡神經細胞。 結果： ①強的松或ACTH在治療劑量下短程或長程給予均可致嬰幼鼠血清NSE顯著增高，短程組分別增高50.62％與57.34％(P＜0.05或P＜0.01)，長程組分別增高103.23％與100.04％(P＜0.01)；成年鼠僅在兩藥治療劑量下長程給藥時方顯著增高，分別為66.81％和60.40

13、％(P＜0.05)。停藥4周后，各組NSE較對照組已無顯著差異。 ②短程或長程給予兩藥的嬰幼或成年各組額葉及海馬皮層Bc1-2蛋白表達與對照組相比均無顯著差異。 ③短程給藥時Bax蛋白表達僅在兩藥治療劑量嬰幼組有顯著增高(P＜0.01)，Bax/Bc1-2比值亦升高為對照組的1.91～2.29倍，而成年鼠則無顯著增高。兩藥長程治療劑量和小劑量均致嬰幼組Bax蛋白在額葉和海馬皮層表達顯著增高，Bax/Bc1-2比值達對照組

14、的1.92～2.70倍，而成年鼠僅治療劑量下在海馬皮層有增高。停藥4周后各組Bax以及Bax/Bc1-2比值均恢復至對照組水平。 ④兩藥短程治療劑量、長程兩劑量嬰幼組的額葉及海馬皮層，長程治療劑量成年組的海馬皮層，均較對照組TUNEL陽性細胞表達明顯增多，停藥4周后均消失。 結論： ①除過度凋亡外，以海馬為主的神經細胞壞死也是強的松與ACTH導致嬰幼腦損傷的主要機制。 ②Bax蛋白表達和Bax/Bc1-2