非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎小鼠模型的建立及其免疫學(xué)損傷機(jī)制的研究.pdf

1、背景及目的:
　　非酒精性脂肪性肝?。∟on-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）是代謝綜合征在肝臟的表現(xiàn)，包括單純性脂肪肝（simple steatosis），非酒精性脂肪性肝炎（Non-alcoholic steatohepatitis，NASH），以及NASH相關(guān)的肝纖維化/肝硬化、肝癌。隨著生活水平的提高，NAFLD在發(fā)展中國(guó)家的發(fā)病率顯著上升，我國(guó)NAFLD患者數(shù)量在過去的10年增加了

2、近一倍，部分地區(qū)的發(fā)病率已達(dá)四分之一。同時(shí)，我國(guó)是病毒性肝炎感染的高發(fā)地區(qū)，約有1億HBV感染者及4000萬HCV感染者，其中合并NAFLD的患者有逐年增加的趨勢(shì)，這一部分人群已經(jīng)引起了研究者們的注意。
　　目前關(guān)于NAFLD合并病毒性肝炎的研究多集中在NAFLD合并慢性丙型肝炎(Chronic hepatitis C,CHC)：NAFLD可以增加CHC患者進(jìn)展為肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcino

3、ma,HCC)的風(fēng)險(xiǎn)，并降低抗病毒治療的療效。但是，丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)本身具有致肝細(xì)胞脂肪變的作用，因此在NAFLD合并CHC患者中得到的結(jié)論可能并不能推而廣之。關(guān)于NAFLD對(duì)慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)的影響，目前的研究結(jié)果卻并不一致，與CHC中看到的現(xiàn)象也不相同。部分研究認(rèn)為，肝臟脂肪變對(duì)CHB具有保護(hù)作用：在脂肪肝患者中，乙型肝炎病毒(Hepatitis

4、B virus,HBV)載量更低，乙肝病毒表面抗原(Hepatitis B surface antigen,HBsAg)清除率更高。但另一方面，一些研究顯示，脂肪肝可能會(huì)增加CHB患者發(fā)展為肝硬化及HCC的風(fēng)險(xiǎn)，降低恩替卡韋抗病毒治療的效果。還有一些研究認(rèn)為，脂肪肝對(duì)HBV病毒載量及干擾素抗病毒治療無影響。事實(shí)上，這方面的研究存在許多難點(diǎn)，可能是導(dǎo)致這些矛盾結(jié)論的原因。首先，研究中多用肝臟超聲診斷脂肪肝。肝臟超聲檢查僅能檢出肝內(nèi)脂肪沉積

5、超過30％的中度脂肪肝，難以檢出輕度脂肪肝（肝臟內(nèi)脂肪沉積為5％-30％），因此在分組時(shí)，可能將輕度脂肪肝患者作為無脂肪肝的對(duì)照。其次，在研究NAFLD合并CHB時(shí)，難以保證受試者在代謝、病毒、治療等多種因素上的一致性。第三，人群研究難以獲取肝組織觀察肝內(nèi)免疫、代謝等方面的改變。因此，NAFLD在慢性病毒性肝炎中的影響仍不明確。
　　動(dòng)物模型可以克服上述臨床研究中的不足，但目前尚缺乏NAFLD合并病毒性肝炎的動(dòng)物模型。為了更好的研

6、究NAFLD對(duì)慢性病毒性肝炎的影響，本研究的具體研究目標(biāo)如下：
　　1.成功建立飲食誘導(dǎo)的NAFLD合并病毒性肝炎小鼠模型；
　　2.在飲食誘導(dǎo)的NAFLD合并病毒性肝炎小鼠模型中，動(dòng)態(tài)觀察肝炎病毒的復(fù)制情況及肝組織損傷程度；
　　3.探討NAFLD影響病毒性肝炎病程的相關(guān)免疫學(xué)機(jī)制。
　　方法:
　　1.采用60％高脂飲食（High fatty diet,HFD）喂養(yǎng)C3H/HeN小鼠12周，觀察小鼠一般

7、狀態(tài)及生活習(xí)性改變，觀察體重、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate aminotransferase,AST）、甘油三酯(Triglyceride,TG)、總膽固醇(Total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白(High density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白（Low density lipoprotein,LDL)、血糖（Glucos

8、e,GLU）、胰島素水平及穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)（Homeostasis Model Assessment-Insulin Resistance,HOMA-IR）的動(dòng)態(tài)變化及肝臟組織學(xué)變化。
　　2.3型鼠肝炎病毒（Murine hepatitis virus-3,MHV-3）腹腔注射感染NAFLD小鼠，觀察小鼠一般狀態(tài)及生存率；動(dòng)態(tài)觀察小鼠感染后血清生化學(xué)變化及肝臟病理改變；逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse transcr

9、iption-polymerase chain reaction,RT-PCR）檢測(cè)小鼠肝內(nèi)MHV-3。
　　3. MHV-3腹腔感染NAFLD小鼠及正常飲食（Normal diet, ND）小鼠，比較兩組小鼠生存率；比較兩組小鼠各時(shí)間點(diǎn)血清生化學(xué)變化及肝組織病理改變；實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time polymerase chain reaction,Real-time PCR)檢測(cè)并比較各時(shí)間點(diǎn)兩組小鼠肝內(nèi)MHV-3復(fù)

10、制情況。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MHV-3感染后各時(shí)間點(diǎn)小鼠肝內(nèi)CD3+CD8+CD69+T細(xì)胞、CD3+CD8+PD-1+T細(xì)胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例的變化，并比較兩組小鼠之間的差異；Real-time PCR檢測(cè)并比較兩組小鼠MHV-3感染后各時(shí)間點(diǎn)肝內(nèi)IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-22、IL-33、TNF-α、Fgl2的表達(dá)，并比較兩組小鼠之間的差異。
　　結(jié)果:

11、>　　1.成功建立NAFLD小鼠模型。HFD飲食喂養(yǎng)12周，C3H/HeN小鼠體型肥胖，皮毛油膩，不喜活動(dòng)，體重明顯增加；外周血ALT及AST水平無顯著升高；TG、TC、HDL、LDL、GLU、胰島素水平及HOMA-IR均顯著升高；小鼠肝臟體積增大，肝重高于ND組，邊緣圓鈍，色澤紅黃，表面光滑，有油膩感；肝組織切片HE染色及油紅O染色可見肝細(xì)胞內(nèi)大量脂滴形成。
　　2.成功建立飲食誘導(dǎo)的NAFLD合并病毒性肝炎小鼠模型。NAFLD

12、小鼠感染MHV-3病毒后，在3-12天內(nèi)出現(xiàn)死亡，死亡率約為20％；感染小鼠外周血ALT和AST水平顯著升高；感染小鼠肝臟蒼白，缺乏光澤，并可見彌漫分布的針尖樣出血點(diǎn)；HE染色除可見肝細(xì)胞內(nèi)脂滴形成，還可見肝細(xì)胞胞漿疏松、肝細(xì)胞壞死、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等表現(xiàn)；PCR可檢測(cè)到肝內(nèi)MHV-3病毒復(fù)制。
　　3.NAFLD小鼠感染MHV-3病毒后，生存率與對(duì)照組無差異；MHV-3病毒復(fù)制高于對(duì)照組，于感染4天時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.002）；

13、ALT及AST升高幅度大于ND組；肝組織炎癥壞死程度交對(duì)照組嚴(yán)重。
　　4.NAFLD小鼠感染MHV-3病毒后，肝內(nèi)IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-33、TNF-α、Fgl2表達(dá)水平上調(diào)，且上調(diào)幅度大于ND組小鼠，而IL-22表達(dá)水平降低，且降低幅度大于對(duì)照組小鼠。
　　5.NAFLD小鼠感染MHV-3病毒后，肝內(nèi)CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例降低，但感染第16天開始高于ND組小鼠；CD

14、3+CD8+CD69+T及CD3+CD8+PD1+T細(xì)胞均出現(xiàn)升高，上升幅度大于ND組小鼠，且細(xì)胞比例回落后仍持續(xù)高于ND組小鼠。
　　結(jié)論:
　　1.本研究采用HFD喂養(yǎng)C3H/HeN小鼠12周成功建立NAFLD小鼠模型，并在此基礎(chǔ)上采用MHV-3病毒腹腔感染小鼠，成功建立NAFLD合并病毒性肝炎小鼠模型。為研究NAFLD對(duì)病毒性肝炎的影響提供了動(dòng)物模型，開辟了新的研究途徑。
　　2.NAFLD可以加劇肝內(nèi)MHV-3