乙型肝炎病毒持續(xù)復(fù)制合并非酒精性脂肪性肝病小鼠模型的建立及代謝學(xué)機(jī)制的探索.pdf

1、目的：
　　非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是代謝綜合征在肝臟的具體表現(xiàn)。NAFLD病理學(xué)變化，主要為肝細(xì)胞的脂肪變性。疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝(non-alcoholic simple fatty liver, NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitish, NASH)、肝硬化、肝細(xì)胞癌（HCC）。隨著肥胖

2、相關(guān)的代謝綜合征在世界范圍的流行，近些年亞洲國(guó)家NAFLD增長(zhǎng)迅速、低齡化。在中國(guó)發(fā)達(dá)地區(qū)， NAFLD患病率約達(dá)15％。然而NAFLD的病因和發(fā)病機(jī)制并不明確。我國(guó)仍是病毒性肝炎高發(fā)國(guó)家，以慢性HBV和HCV感染為主。而隨著NAFLD的流行，慢性病毒性肝炎合并NAFLD的發(fā)病率逐年上升，有些地區(qū)發(fā)病率高達(dá)27%-51%，這兩種疾病的合并引起了我們廣泛關(guān)注。
　　目前，關(guān)于HCV合并NAFLD，已有一些比較明確研究。NAFLD可促

3、進(jìn)HCV患者進(jìn)展為肝硬化、肝癌，而HCV又可導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性，因而形成正反饋進(jìn)一步加重NAFLD的進(jìn)展。而HBV合并NAFLD患者中，HBV復(fù)制和NAFLD相互關(guān)系，尚無(wú)定論。目前，該領(lǐng)域的研究主要集中在對(duì)一些臨床現(xiàn)象的觀察，且研究結(jié)果尚不一致。NAFLD的研究主要集中在對(duì)一些臨床現(xiàn)象的觀察，且研究結(jié)果尚不一致。部分研究認(rèn)為，NAFLD促進(jìn)HBV清除；有些研究表示，NAFLD對(duì)HBV復(fù)制沒(méi)有影響；還有研究證明，脂肪肝可促進(jìn)HBV復(fù)制，

4、降低CHB的抗病毒療效，增加CHB進(jìn)展為肝硬化、HCC的風(fēng)險(xiǎn)。關(guān)于HBV是否也如HCV一樣，可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變？是否會(huì)引起脂質(zhì)代謝紊亂？目前這方面的研究主要利用通過(guò)轉(zhuǎn)染HBV相關(guān)質(zhì)粒入肝癌等細(xì)胞模型以及臨床病人標(biāo)本，臨床病人主要通過(guò)超聲診斷脂肪肝，病人肝穿樣本為診斷脂肪肝的金標(biāo)準(zhǔn)，但存在樣本數(shù)量有限以及病人的依從性等不足。動(dòng)物模型能避免以上兩種模型的缺陷，但目前乙型病毒性肝炎合并NAFLD的動(dòng)物模型主要是轉(zhuǎn)基因小鼠，缺乏免疫完全的乙型

5、肝炎病毒持續(xù)復(fù)制的小鼠模型，而本研究提供的動(dòng)物模型可以彌補(bǔ)以上的不足。本研究的具體目標(biāo)如下：
　　1.建立HBV持續(xù)復(fù)制合并NAFLD的動(dòng)物模型；
　　2.觀察NAFLD對(duì)HBV復(fù)制的影響以及動(dòng)態(tài)觀察HBV對(duì)脂質(zhì)代謝的影響，主要是對(duì)膽固醇的合成和代謝的影響，并探討相關(guān)代謝分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.通過(guò)尾靜脈高壓注射基因B型的HBV復(fù)制DNA質(zhì)粒（pGEM4Z/HBV1.3）到FVB/N雄性小鼠肝細(xì)胞內(nèi)，隔日

6、眼內(nèi)眥靜脈采血檢測(cè)血清HBeAg的滴度, HBeAg陽(yáng)性小鼠開(kāi)始采用60%高脂飼料喂養(yǎng)14周，觀察小鼠的狀態(tài)、體重以及習(xí)性的改變，檢測(cè)血清生化指標(biāo)（ALT、AST、Glucose、HDL、LDL、TG、TC、胰島素）和動(dòng)態(tài)觀察肝組織切片的變化（HE、油紅染色）。
　　2采用.免疫組化測(cè)肝組織 HBcAg表達(dá)，免疫化學(xué)發(fā)光方法測(cè)血清HBeAg和肝組織HBsAg。定量PCR以及Southernblot測(cè)肝組織HBV DNA，觀察HBV

7、復(fù)制的變化。肝組織勻漿酶法定量檢測(cè)TG和TC，RT-PCR測(cè)肝組織TC合成和代謝相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)觀察HBV持續(xù)復(fù)制對(duì)TC代謝的影響。
　　3.采用MDA-TBA法，檢測(cè)肝組織脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA。
　　結(jié)果：
　　1.成功建立HBV持續(xù)復(fù)制合并NAFLD的動(dòng)物模型。隔日采血，小鼠血清HBeAg帶原率85%左右。高脂飲食喂養(yǎng)14周，F(xiàn)VB/N小鼠不喜活動(dòng)，體型肥胖，毛發(fā)油膩，體重明顯增加；小鼠血清HBeAg帶原率下降為70

8、%左右；外周血生化指標(biāo)（ALT、AST、Glucose、HDL、LDL、TG、TC、胰島素）及HOMA-IR明顯升高且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），小鼠肝重較對(duì)照組（ND）增加，肝組織色澤偏黃，邊緣圓鈍，表面有油膩感，觸之易碎；肝組織HE和油紅切片染色，可見(jiàn)肝細(xì)胞有大量脂肪滴存在。
　　2.免疫組化表明HBcAg在HBV、HBV合并NAFLD組的肝細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)，高倍視野下，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（400倍），在HBV合并NAFLD組降低，有

9、統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；免疫化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清HBeAg和肝組織HBsAg發(fā)現(xiàn)在合并組較HBV組均明顯下降且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；定量PCR檢測(cè)肝組織HBV DNA顯示在合并組較HBV組明顯下降，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)以及Southernblot也證明HBV在合并組復(fù)制減少，同時(shí)HBV DNA與HBeAg、HBsAg及HBcAg有較強(qiáng)的正相關(guān)。
　　3.酶法檢測(cè)肝組織TG，HFD組較ND組明顯增加且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

10、（P<0.05）；酶法檢測(cè)肝組織TC及RT-PCR檢測(cè)TC合成和代謝的基因（SREBP2、HMGCR、LDLR、CYP7a）顯示，造模第4W四個(gè)實(shí)驗(yàn)組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，6W HBV組肝組織TC和TC合成基因較HBV合并NAFLD組、NAFLD組、Control組增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），持續(xù)到10W、12W，然而，在14W四組肝組織TC無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，相關(guān)基因明顯下調(diào)，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　4.MDA-TBA

11、法檢測(cè)肝組織脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA，HBV組較HBV合并NAFLD組、NAFLD組、Control組明顯增加，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.本研究成功建立HBV持續(xù)復(fù)制合并NAFLD小鼠模型，為研究二者之間的相互關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。
　　2.在該模型中，NAFLD可以抑制HBV的復(fù)制，降低外周血HBeAg、肝組織HBsAg和HBcAg。
　　3.在該模型中，HBV持續(xù)復(fù)制，可影響TC代謝相關(guān)基因的