白蛋白致腎小管間質(zhì)損害研究.pdf

1、蛋白尿致腎損害的機(jī)理尚未完全清楚。目前較一致的觀點(diǎn)認(rèn)為，蛋白尿可能是通過(guò)引起腎小管間質(zhì)損害而影響腎小球疾病進(jìn)展的。白蛋白是尿蛋白中最主要的成分。研究表明，大劑量白蛋白對(duì)腎小管上皮細(xì)胞存在直接損害作用。在體外，白蛋白超載腎小管上皮細(xì)胞可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)一系列生長(zhǎng)因子和前炎癥因子，其中包括介導(dǎo)腎間質(zhì)纖維化和腎小球硬化最重要的因子——轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)。但是白蛋白超載誘導(dǎo)的這些細(xì)胞因子必須穿越腎小管基底膜進(jìn)入到腎間質(zhì)才有可能

2、介導(dǎo)腎間質(zhì)損害和纖維化。基質(zhì)金屬蛋白酶-2和-9(MMP-2和MMP-9)是可以降解Ⅳ型、Ⅴ型膠原和層粘連蛋白等的酶類(lèi)，被認(rèn)為在影響基底膜結(jié)構(gòu)的完整性中起重要作用。過(guò)度表達(dá)的MMP-2和MMP-9與腎小管基底膜的破壞和腎間質(zhì)纖維化相關(guān)。而TGF-β可以誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)MMP-2和MMP-9。近年來(lái)的研究還發(fā)現(xiàn)，在腎臟纖維化的過(guò)程中，腎小管上皮細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為成肌纖維細(xì)胞(EMT)，并可以遷移進(jìn)入到間質(zhì)，成為腎間質(zhì)成肌纖維細(xì)胞的主要來(lái)源

3、之一。研究發(fā)現(xiàn)，白蛋白超載可以誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)TGF-β，單核細(xì)胞趨化因子(MCP-1)和氧自由基(ROS)等，而這些因子在體外被證實(shí)可以誘導(dǎo)或促進(jìn)腎小管細(xì)胞向成肌纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。 目的本研究擬通過(guò)臨床和實(shí)驗(yàn)研究探討尿蛋白中的主要成分白蛋白致腎小管間質(zhì)損害的機(jī)理。臨床研究部分：觀測(cè)難治性原發(fā)性腎病綜合征患者蛋白尿與腎小管間質(zhì)損害和腎小球功能損害的關(guān)系，并分析其與病情進(jìn)展的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)研究部分：(一)白蛋白超載腎小管上皮細(xì)胞對(duì)M

4、MP-2和MMP-9酶活性和蛋白水平的影響。(二)白蛋白超載對(duì)腎小管上皮細(xì)胞向成肌纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)型的研究。通過(guò)上述研究，進(jìn)一步了解蛋白尿致腎小管間質(zhì)損害的機(jī)理，為臨床防治蛋白尿所致腎臟損害提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。 材料和方法[難治性原發(fā)性腎病綜合征患者蛋白尿與腎小管間質(zhì)損害和腎功能的關(guān)系]1.病例選擇和分組：本院1991年-2005年難治性原發(fā)性腎病綜合癥(包括激素耐藥，激素依賴(lài)和頻繁復(fù)發(fā))患者，經(jīng)腎活檢病理診斷為輕微病變腎病(MCD

5、)，系膜增生性腎小球腎炎(MsPGN)或局灶節(jié)段腎小球硬化(FSGS)，并符合以下要求者：(1)持續(xù)蛋白尿組(甲組)：腎穿刺前，尿蛋白+以上，持續(xù)6個(gè)月以上；偶然可由-～±，但持續(xù)時(shí)間不超過(guò)2周。(2)間歇性蛋白尿組(乙組)：腎穿刺前，尿蛋白間歇出現(xiàn)，病程6個(gè)月以上，無(wú)蛋白尿(尿蛋白-～±)在時(shí)間占整個(gè)病程的一半以上。符合要求病例共49例，男35例，女14；年齡1.4-15歲，病程6-108月，追蹤時(shí)間5-92月。持續(xù)蛋白尿組患兒18例

6、，間歇蛋白尿組患兒31例。 2、觀察指標(biāo)1)、臨床資料：患兒年齡，性別，24小時(shí)尿蛋白定量，血肌酐，尿β2-微球蛋白(β2-MG)，尿N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶(NAG)，血白蛋白(ALB)，血膽固醇(CHOL)。 2)、病理資料：腎小管間質(zhì)組織學(xué)改變的評(píng)價(jià)方法，將腎小管間質(zhì)改變分為四級(jí)：0級(jí)：間質(zhì)正常，腎小管無(wú)改變；Ⅰ級(jí)，間質(zhì)極少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)纖維組織增生，病變＜20％；Ⅱ級(jí)，腎小管上皮細(xì)胞萎縮，變性，壞死輕，呈灶狀

7、分布，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維組織增生，呈小灶狀分布，20％＜病變＜50％；Ⅲ級(jí)，腎小管上皮細(xì)胞萎縮，變性，壞死重，呈片狀分布，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維組織呈多灶狀或彌漫增生，病變＞50％。腎小球病理?yè)p害半定量分析按以下幾方面統(tǒng)計(jì)：系膜增生程度分級(jí)：0級(jí)，正常；Ⅰ級(jí)，輕度增生；Ⅱ級(jí)，中度增生；Ⅲ級(jí)，重度增生。節(jié)段性硬化，新月體和球性硬化分別以受累腎小球數(shù)除以送檢腎小球總數(shù)進(jìn)行校正后的值為實(shí)測(cè)值。 [白蛋白誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞向

8、成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的研究]NRK52E近端小管細(xì)胞(PTCs)接種在用Ⅰ型膠原包被的6孔培養(yǎng)板或每孔含有4片蓋玻片的6孔培養(yǎng)板上。培養(yǎng)PTCs至70％融合(未完全融合)或100％融合(完全融合)時(shí)，去血清培養(yǎng)24小時(shí)。然后分別給予不同濃度的去脂或非去脂牛血清白蛋白(dBSA/BSA)，濃度范圍：0，0.5，1，5，10，30mg/ml。其中dBSA或BSA0mg/ml為對(duì)照細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)觀察48，72和144小時(shí)。部分實(shí)驗(yàn)觀察192小時(shí)。PTC

9、s形態(tài)和結(jié)構(gòu)改變用光鏡和電鏡觀測(cè)。上皮細(xì)胞標(biāo)記抗原：E-鈣粘蛋白和β-連環(huán)蛋白，以及成肌纖維細(xì)胞標(biāo)記抗原：α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的表達(dá)用免疫熒光和Western印跡法檢測(cè)。同時(shí)觀測(cè)細(xì)胞增殖(用MTT，即四甲基偶氮唑鹽，比色法)和細(xì)胞凋亡(用末端標(biāo)記法，即TUNEL法，DNA梯帶和苔盼藍(lán)染色法)。 結(jié)果[難治性原發(fā)性腎病綜合征患者蛋白尿與腎小管間質(zhì)損害和腎功能的關(guān)系]1.尿蛋白與腎小管間質(zhì)損害、腎小球病理?yè)p害和腎功能的關(guān)

10、系。持續(xù)蛋白尿患兒腎間質(zhì)病理?yè)p害(平均秩和：33.44)較間歇性蛋白尿患兒的(平均秩和：20.10)嚴(yán)重，差異有顯著性，P＜0.05。兩組患兒腎小球病理?yè)p害比較，除了系膜增生程度兩組間比較(平均秩和：29.67比22.29)差異有顯著性外，P＜0.05。球性硬化，節(jié)段硬化和新月體程度，兩組比較差異均無(wú)顯著性。臨床觀察指標(biāo)的比較，兩組患兒血肌酐(147.62±214.97umol/L比59.84±64.64umol/L)、血BUN(12.

11、64±9.13mmol/L比7.01±7.02mmol/L)和β2-MG(1776±1004ug/L比694.80±1135ug/L)比較差異有顯著性，P＜0.05。但兩組患兒血白蛋白、血膽固醇、24小時(shí)尿蛋白定量和尿NAG的差異無(wú)顯著性，P＞0.05。 2.腎小管間質(zhì)損害與腎小球病理?yè)p害和腎功能的關(guān)系由于腎小管間質(zhì)病理?yè)p害Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)的病例數(shù)較少，兩組合并后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。結(jié)果，腎小管間質(zhì)病理?yè)p害Ⅱ+Ⅲ級(jí)患兒球性硬化(平均秩和：

12、35.83)較Ⅰ級(jí)(22.79)和0級(jí)(22.48)患兒高，差異均有顯著性，P＜0.05。腎小管間質(zhì)病理?yè)p害Ⅱ+Ⅲ級(jí)患兒系膜增生程度(平均秩和：35.83)較0級(jí)患兒(22.63)高，差異有顯著性，P＜0.05。節(jié)段硬化和新月體程度，在腎小管間質(zhì)病理?yè)p害各分組間的差異均無(wú)顯著性，P＞0.05。腎小管間質(zhì)病理?yè)p害各分級(jí)患兒的臨床觀測(cè)指標(biāo)比較，腎小管間質(zhì)病理?yè)p害Ⅱ+Ⅲ級(jí)患兒血肌酐(198.40±95.74umol/L)、血BUN(16.88

13、±9.43mmol/L)和β2-MG(2797.25±2055.32ug/L)和Ⅰ級(jí)血肌酐(125.59±94.56umol/L)、血BUN(11.00±9.73mmol/L)和β2-MG(926.32±826.59ug/L)較0級(jí)患兒血肌酐(43.60±16.86umol/L)、血BUN(5.93±4.91mmol/L)和β2-MG(6363.34±525.81ug/)升高，差異均有顯著性，P＜0.05；其中β2-MG，Ⅱ+Ⅲ級(jí)患兒又

14、較Ⅰ級(jí)患兒高，差異有顯著性，P＜0.05。但血白蛋白、血膽固醇、24小時(shí)尿蛋白定量和尿NAG各組間比較差異無(wú)顯著性，P＞0.05。 3.尿蛋白及腎小管間質(zhì)病理?yè)p害與病情進(jìn)展的關(guān)系持續(xù)蛋白尿(甲組)和間歇蛋白尿(乙組)患兒追蹤前后腎功能變化比較，兩組忠兒追蹤后的血肌酐和血BUN均較追蹤前高，但差異均無(wú)顯著性，P＞0.05。這可能與病例數(shù)較少有關(guān)。腎間質(zhì)損害各分級(jí)患兒追蹤前后腎功能變化的比較，腎小管間質(zhì)病理?yè)p害Ⅰ級(jí)，或Ⅱ+Ⅲ級(jí)患兒，

15、追蹤后血肌酐較追蹤前升高(Ⅰ級(jí)分別為：61.25±19.25umol/L，47.75±13.67umol/L；Ⅱ+Ⅲ級(jí)分別為：411.00±268.62umol/L，122.40±64.21umol/L)，差異均有顯著性，P＜0.05。腎小管間質(zhì)病理?yè)p害0級(jí)患兒，追蹤后血肌酐較追蹤前(54.50±25.54umol/L，40.33±12.96umol/L)升高，但差異無(wú)顯著性，P＞0.05。提示有腎小管間質(zhì)病理?yè)p害者，病情進(jìn)展快。腎間質(zhì)

16、損害各分級(jí)患兒追蹤后血BUN較追蹤前有所升高，但差異無(wú)顯著性，P＞0.05。 結(jié)論1.在難治性原發(fā)性腎病綜合征患兒，蛋白尿與腎小管間質(zhì)損害和腎功能損害相關(guān)，腎間質(zhì)損害與腎功能損害和病情進(jìn)展相關(guān)。尿蛋白可能影響腎小球疾病的進(jìn)展和預(yù)后。 2.白蛋白超載PTCs可上調(diào)MMP-2和MMP-9。在蛋白尿誘發(fā)的腎小管間質(zhì)損害中，白蛋白超載誘導(dǎo)PTCs產(chǎn)生的MMP-2和MMP-9可能對(duì)TBM起破壞作用。 3.在白蛋白超載的