C末端肽段在RON-RON△160所介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)及致瘤活性中的作用.pdf

1、背景： 受體酪氨酸激酶RON在上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、增殖等過(guò)程中發(fā)揮著一定的作用。RON在乳腺，結(jié)腸，肺，甲狀腺，皮膚，膀胱和胰腺腫瘤等組織中呈高度表達(dá)，而在正常上皮組織中呈低表達(dá)或不表達(dá)。RON的異常表達(dá)常伴隨變異體產(chǎn)生。變異體RON△160的過(guò)度表達(dá)是結(jié)腸癌細(xì)胞的一個(gè)特征。RON含有多個(gè)功能性的結(jié)構(gòu)域，如胞外的SEMA結(jié)構(gòu)域、PSI基團(tuán)、IPT單位和胞內(nèi)的鄰膜區(qū)、激酶區(qū)和C—末端磷酸化位點(diǎn)等。不同的結(jié)構(gòu)域在RON介導(dǎo)的生物學(xué)

2、活性中發(fā)揮著不同的作用。缺失或截?cái)喽紩?huì)導(dǎo)致RON受體磷酸化活性改變。變異體RON△160缺失胞外段第一個(gè)IPT單位，使它具有致瘤性。C—末端位于RON第20外顯子，在調(diào)節(jié)RON活性中發(fā)揮兩個(gè)作用。一方面，其包含一個(gè)多功能結(jié)合位點(diǎn)—Y1353VQL—PAT—Y1360序列。該位點(diǎn)能招募下游的信號(hào)分子，如PI-3K，Smad，Grb2，STAT3等。當(dāng)RON與特異性配體結(jié)合后，該位點(diǎn)的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化、傳導(dǎo)信號(hào)。但是包含兩個(gè)突變位點(diǎn)Y1

3、353和Y1360的突變體RONM1254T顯示這個(gè)多功能位點(diǎn)對(duì)致瘤活性不是必需的。另一方面，體外實(shí)驗(yàn)顯示整個(gè)C—末端對(duì)RON激酶活性有自我抑制作用，主要通過(guò)是C—末端Tyr1353/1360殘基與激酶區(qū)TYr1238/1239殘基之間的結(jié)合起作用。研究發(fā)現(xiàn)C—末端的Tyr1353/1360殘基發(fā)生突變或被Phe替代后，C—末端與激酶區(qū)的結(jié)合更加緊密，進(jìn)一步抑制RON活性。因此，C末端在RON介導(dǎo)的生物學(xué)活性中的作用有待于進(jìn)一步研究。

4、 目的： 本課題旨在研究RON蛋白在正常人消化道上皮組織及其癌變細(xì)胞中的表達(dá)狀態(tài)，同時(shí)著重探討RON—C末端肽段在RON及其變異體RON160所介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)及致瘤活性中的作用。 材料與方法： 采用單克隆抗體雜交瘤技術(shù)，制備并鑒定數(shù)個(gè)具有生物學(xué)活性的特異性抗RON單克隆抗體。通過(guò)免疫組織化學(xué)的方法，用抗RON單抗(2F2)，檢測(cè)了RON在正常人消化道及癌癥組織中的表達(dá)。所用的組織芯片類(lèi)型包括：正常成人、胚胎

5、及多種消化道腫瘤組織。利用PCR方法構(gòu)建了C末端缺失的兩個(gè)RON變異體——RON—CF和RON△160—CF。通過(guò)細(xì)胞表達(dá)、蛋白化學(xué)分析、生物學(xué)功能及動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)方法，研究了C末端在RON及RON△160在促進(jìn)細(xì)胞侵襲性生長(zhǎng)中的一些作用及機(jī)理。 結(jié)果： 1、成功制備了特異性抗RON單克隆抗體Zt/g4、2F2和2C6，初步鑒定了它們?cè)诿庖呓M化、ELISA、免疫沉淀、免疫熒光等方面的性狀。其中Zt/g4和2F2主要識(shí)

6、別RON胞外段，兩者都具有激活RON磷酸化的活性。2C6主要識(shí)別胞內(nèi)段，沒(méi)有明顯抑制或激活RON的生物學(xué)活性；2、組織芯片的免疫組化結(jié)果顯示，RON在消化系統(tǒng)的胚胎和成人組織中幾乎不表達(dá)或呈低水平表達(dá)，兩者的表達(dá)和分布沒(méi)有明顯差異；在食道癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌組織中，RON蛋白呈異常表達(dá)，其中50％以上的結(jié)直腸癌組織中RON為過(guò)度表達(dá)；3、C末端缺失的RON蛋白呈現(xiàn)明顯的生化及生物學(xué)功能的異常，主要表現(xiàn)為：1)C末端缺失后導(dǎo)致RON受

7、體無(wú)法發(fā)生二聚體化，蛋白磷酸化的作用消失；2)在RON介導(dǎo)的信號(hào)通路中，C末端缺失后RON/RON△160的自體磷酸化功能喪失、下游信號(hào)蛋白(Erk1/2、AKT)的磷酸化也抑制，RON△160介導(dǎo)的細(xì)胞漿內(nèi)β—catenin的積聚的功能減弱；3)C末端去除后導(dǎo)致RON△160介導(dǎo)的細(xì)胞增殖、形態(tài)改變、遷移和動(dòng)物體內(nèi)致瘤效應(yīng)等活性明顯喪失。 結(jié)論： RON蛋白在正常人胚胎和成人消化道上皮組織中呈微量表達(dá)狀態(tài)，而在部分消化