肺癌和乳腺癌病人DNA修復能力及關卡基因蛋白（ATM蛋白）的研究.pdf

1、腫瘤系環(huán)境因素與機體因素(遺傳因素)相互作用的結果，因此屬于環(huán)境相關疾病。例如空氣和水污染、吸煙、飲食、職業(yè)接觸和個人生活方式與習慣等都是與腫瘤發(fā)生密切相關的環(huán)境因素。同時機體因素在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中也起了十分重要的作用，因此，美國1997年啟動環(huán)境基因組計劃(EnvironmentalGenomicsProject，EGP)，旨在研究環(huán)境相關疾病中機體應答基因作用，包括DNA修復基因。圖一系腫瘤發(fā)生過程中機體DNA修復能力所起的作用

2、。 DNA修復是細胞保護基因組完整性的重要功能系統(tǒng)之一，機體DNA修復能力的降低與癌癥的發(fā)生密切相關。因此，DNA修復能力，及其對癌癥易感性的影響成為目前環(huán)境腫瘤流行病學研究的重點。環(huán)境致癌因素誘發(fā)的DNA損傷信號被傳送多個效應子。在這個過程中關卡基因(checkpointgene)(ATM)蛋白起了很重要的作用。ATM(ataxiatelangiectasiamutated)蛋白是一種多功能蛋白激酶，在損傷最早期階段和啟動關卡

3、信號中起關鍵作用，它通過磷酸化一系列參與不同細胞反應的下游底物來應對DNA損傷。因為肺癌和乳腺癌都是與環(huán)境因素密切相關的腫瘤，本研究將DNA修復能力作為研究中心，評價個體的DNA修復能力，比較腫瘤病人和對照人群的DNA修復能力差異，分析DNA修復能力與癌癥易感性的關聯(lián)；同時觀察肺癌和乳腺癌病人ATM蛋白的表達水平是否下降，以及與DNA修復能力的關系。為肺癌和乳腺癌易感人群研究及預防提供分子生物學依據。本研究分以下幾部分：前期工作：方法學

4、研究。 (1)用彗星試驗檢測人淋巴細胞DNA修復能力的方法學研究。(UV攻擊試驗) (2)用兩種作用機制不同的攻擊試驗來同時評價癌癥被人的DNA修復能力。 研究重心：(3)乳腺癌病人DNA修復能力及ATM蛋白的研究。 (4)肺癌病人DNA修復能力及ATM蛋白的研究。 第一部分彗星試驗檢測紫外線暴露后人淋巴細胞DNA修復能力DNA修復的途徑有堿基切除修復(BER)、核苷酸切除修復(NER)、同源重組

5、修復(HRR)、非同源末端連接(NHEJ)和錯配修復(MMR)，其中以NER較為重要。目前測定DNA修復能力的方法有五類，在進行分子流行病學調查時需要一種可靠、靈敏、快速的方法。研究結果顯示，在單純UVC照射后，11人最大尾長均出現于90min，僅5號最大尾長2.96μm出現于120分鐘，略高于90分鐘的2.93μm。240分鐘尾長明顯低于90分鐘(P＜0.01)，接近照射前水平。照射后90分鐘，UVC+NOV組MTL均值為3.16μm

6、明顯低于UVC組的4.77μm(P＜0.01)，UVC+APC組與UVC組無明顯差異。照射后240分鐘，UVC+APC組MTL均值為3.43μm，明顯高于UVC組的2.43μm(P＜0.01)。UVC+NOV組和UVC+APC組DRRs平均值分別為52.98％、39.57％，明顯低于UVC組的81.84％(P＜0.01)。本研究結果表明UVC照射后90分鐘，UVC+NOV組MTL明顯低于UVC組，說明DNA鏈切開受到抑制；UVC照射后2

7、40分鐘，UVC+APC組MTL明顯高于UVC組，說明DNA鏈連結受到抑制。兩組的DRR明顯低于UVC組，說明DRR既能反映切開階段也能反映連接階段受抑制而引起的DNA修復能力下降。因此通過DNA鏈斷裂的動態(tài)變化，計算DNA修復率(DRR)，彗星試驗能有效地用于評價DNA修復能力。 第二部分用UVC攻擊試驗和博來霉素攻擊試驗檢測癌癥病人外周淋巴細胞DNA修復能力在本次研究中利用博來霉素及UVC作為誘變劑來評價個體的DNA修復能力

8、。兩種誘變劑的損傷機理各有不同。UVC誘導產生環(huán)丁烷嘧啶二聚體(CPD)和6-4光產物(6-4PP)，這些DNA損傷主要通過NER修復。而博來霉素誘導單雙鏈斷裂主要通過HRR，BERandNHEJ修復。外周血來自33位混合癌癥病人(均未經任何放化療)和33個對照(按年齡、性別和吸煙與病人配對)。每個樣本分成兩部分：(1)博來霉素攻擊試驗：淋巴細胞用20μg·ml-1博來霉素(BLM)暴露30分鐘后修復15分鐘，再用彗星試驗檢測暴露前后的

9、DNA損傷來評價個體DNA修復能力。(2)紫外線(UVC)攻擊試驗：淋巴細胞經1.5j·m-2劑量UVC(254nm)照射，用彗星試驗檢測暴露前及暴露后90分鐘、240分鐘的DNA損傷，計算DNA修復百分比(DRP)。結果發(fā)現BLM試驗中癌癥病人的DNA修復率分別為75.63±3.11％和68.98±4.19％(以尾長，尾相作為評價指標)，明顯低于對照組的91.11±1.09％和88.19±1.71％(P＜0.01)；UVC試驗中癌癥病

10、人的DNA修復率分別為49.19±3.47％and58.27±3.64％，明顯低于對照組的77.52±2.06％和83.12±2.36％(P＜0.01)。BLM試驗用尾長和尾相計算的DRP(％)之間，及UVC試驗用平均尾長和平均尾相計算的DRP(％)之間存在明顯相關(P＜0.05)，33例癌癥病人在這兩個試驗中DNA修復能力均明顯低于對照組，表明DNA修復能力下降可能是癌癥的易感因素。本研究BLM試驗和UVC試驗的結果相似，但也有一些差

11、異，少數病例在兩種試驗中的修復能力差異明顯，可能系個體對BLM和UVC的易感性不同，或兩種誘變劑誘發(fā)損傷的修復途徑不同所至。因此，我們建議在分子流行病學調查中要用兩種或兩種以上的誘變劑試驗來檢測個體DNA修復能力，更能客觀反映個體的DNA修復能力。 第三部分乳腺癌病人外周淋巴細胞DNA修復能力與ATM蛋白表達的研究為了研究乳腺癌病人ATM蛋白表達與DNA修復能力是否下降以及兩者的關系。外周血樣本采自腫瘤科25例乳腺癌病人和25名

12、年齡、性別和吸煙配對的對照組。所有癌癥患者均未經任何放化療。一部分細胞樣本用彗星試驗檢測DNA修復能力，誘變劑為UVC及BLM。檢測方法同上。剩余細胞樣本提取胞漿蛋白后用westernblot方法檢測每個研究對象的ATM蛋白表達量。實驗結果顯示BLM攻擊試驗中當TL作為計算指標時，乳癌病人25個癌癥病人中只有5人DNA修復百分比大于60％。對照組有21人高于60％。癌癥病人平均DNA修復百分比(40.84％)明顯低于對照組平均DNA修復

13、百分比(77.09％)(P＜0.01)。TM作為計算指標時，其中有7個乳癌病人DNA修復百分比大于60％，而在對照組中，有21人高于60％。癌癥病人平均DNA修復百分比(41.33％)也明顯低于對照組平均DNA修復百分比(77.11％)(P＜0.01)。UVC攻擊試驗中無論是MTL還是MTM作為評價指標，對照組的平均DNA修復百分比明顯高于病人組(P＜0.01)。此外，乳癌病人平均ATM表達水平為0.585。明顯低于對照組平均ATM表達

14、水平(1.561)，兩組有明顯差異(P＜0.01)。當各項DNA修復百分比與ATM蛋白表達量作相關分析時，發(fā)現ATM蛋白表達量與BLM攻擊試驗所測的DNA修復百分比有明顯的相關性，相關系數分別為0.624(尾長)和0.629(尾相)(P＜0.01)。 第四部分肺癌病人淋巴細胞DNA修復能力與ATM蛋白表達的研究本試驗研究目的：(1)用BLM試驗和UVC試驗來檢測肺癌病人DNA修復能力是否降低；(2)肺癌病人對兩種誘變劑是否存在修

15、復的個體差異；(3)肺癌病人ATM蛋白表達水平是否下降及與DNA修復能力是否有相關性。外周血采自36例肺癌病人(均未經任何放化療)和36名對照，淋巴細胞分為三部分。兩部分血分別用UVC試驗和BLM試驗來檢測個體DNA修復能力。第三部分血分離蛋白并用Westernblot檢測ATM蛋白表達量。結果發(fā)現肺癌病人在兩種攻擊試驗中測得的DNA修復能力都要明顯低于對照組(P＜0.01)。并且部分病人在兩種攻擊試驗中表現出很大的修復差異。同時，結果

16、顯示癌癥病人ATM蛋白表達量明顯低于對照組(P＜0.05)。并且肺癌病人ATM蛋白表達量與BLM試驗檢測的DNA修復能力存在很高的相關性(P＜0.01)。 結論1.彗星試驗是一種快速，簡便，有效的檢測DNA損傷水平的實驗方法。結合誘變劑(UV)攻擊試驗，彗星試驗通過檢測DNA鏈斷裂的動態(tài)變化，能有效地來評價DNA修復能力。 2.DNA修復能力下降是多種癌癥包括乳腺癌，肺癌的易感因素之一。本課題研究發(fā)現，同一個體在不同的D

17、NA修復通道上表現出不同的活性。因此，我們建議在分子流行病學調查中最好采用兩種或兩種以上的誘變劑試驗來檢測個體DNA修復能力。以便較客觀地反映個體的'DNA修復能力。 3.UVC誘導6-4光化學產物和環(huán)丁烷嘧啶二聚體主要通過NER途徑修復。BLM是一種擬放射樣化合物，誘導的單雙鏈斷裂主要通過BER，HRR和NHEJ途經修復。而ATM蛋白是處于DNA損傷應激網絡頂端的主要起始信號蛋白之一，DNA雙鏈斷裂引起的染色體結構改變能迅速引