干擾素-γ及其第三內(nèi)含子區(qū)域基因多態(tài)性與多發(fā)性硬化的相關(guān)性研究.pdf

1、多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘為主要特征的自身免疫性疾病，有遺傳易感性?，F(xiàn)普遍認(rèn)為MS是一種遺傳易感個(gè)體在某些環(huán)境因素影響下通過變態(tài)反應(yīng)性免疫障礙而引發(fā)的多病因疾病。 干擾素-γ(interferon gamma，IFN-γ)是一種參與免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子，具有廣泛的誘導(dǎo)炎癥和很強(qiáng)的調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活性的功能。近來研究表明IFN-γ水平在MS急性期增高并隨病情好轉(zhuǎn)下降，IFN-γ

2、與髓鞘脫失、軸索變性有關(guān)。IFN-γ基因位于人第12對染色體，由四個(gè)外顯子和三個(gè)內(nèi)含子組成，第一內(nèi)含子區(qū)+874位點(diǎn)T/A具有單核苷酸多態(tài)性，但研究證明，此位點(diǎn)的基因多態(tài)性與MS的易患性不相關(guān)。有研究顯示IFN-γ第三內(nèi)含子區(qū)+2118位點(diǎn)A/G、+2707位點(diǎn)G/A、+3586位點(diǎn)G/ACT具有單核苷酸多態(tài)性，但這三個(gè)位點(diǎn)的基因多態(tài)性與MS易患性的相關(guān)性尚未見報(bào)道，因此，我們在分子生物學(xué)水平探討IFN-γ第三內(nèi)含子區(qū)這三個(gè)位點(diǎn)基因多態(tài)

3、性狀況及其與MS易患性的相關(guān)性進(jìn)行了以下探討。 目的：1.從分子生物學(xué)水平研究MS的易患性與IFN-γ第三內(nèi)含子區(qū)這三個(gè)位點(diǎn)基因多態(tài)性的相關(guān)性，探討其在MS疾病中的作用。2.研究MS患者血清及CSF中IFN-γ水平的變化，探討IFN-γ在MS發(fā)病中的作用。3.分析EDSS評(píng)分與病程、首次發(fā)病年齡、發(fā)病次數(shù)的相關(guān)性。 方法：1.病例組：選擇58例河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院新住院MS患者，臨床表現(xiàn)符合Poser等制定標(biāo)準(zhǔn)的確診(d

4、efinite)或很可能(probable)MS診斷，并詳細(xì)記錄病程、復(fù)發(fā)次數(shù)、致殘?jiān)u分、家族史、生存環(huán)境、誘發(fā)因素、輔助檢查：誘發(fā)電位、MRI等臨床資料。對照組：選擇40例無血緣關(guān)系的健康人，年齡、性別均與病例組匹配，近期無感染、未應(yīng)用免疫抑制劑。2.抽取研究對象清晨空腹靜脈血，并用EDTA抗凝，三天內(nèi)以一步法快速自血中提取基因組DNA。3.采用PCR方法進(jìn)行IFN-γ目的基因擴(kuò)增，擴(kuò)增片段進(jìn)行8％聚丙烯酰胺凝膠電泳，結(jié)果參照Mark

5、er標(biāo)準(zhǔn)判斷。4.采用限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)方法進(jìn)行IFN-γ基因多態(tài)性分析。酶切產(chǎn)物采用8％聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并應(yīng)用凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察帶型，進(jìn)行等位基因分型。5.血液及CSF標(biāo)本應(yīng)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫(ELISA)方法測定IFN-γ含量。6.對MS患者分別進(jìn)行神經(jīng)功能缺損程度的EDSS(an expanded disabilitystatus,EDSS)評(píng)分，首發(fā)年齡，病程，發(fā)病次數(shù)等臨床資料收集。7.應(yīng)用SPSS

6、11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，IFN-γ含量以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)。對照組和病例組基因型的分布應(yīng)首先經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，證明有群體代表性。IFN-γ的基因型及等位基因數(shù)用直接記數(shù)法記數(shù)，并計(jì)算各等位基因頻率，組間比較采用X2檢驗(yàn)或Fisher法。用Woolf公式計(jì)算相對風(fēng)險(xiǎn)率(RR)值，顯著檢驗(yàn)水準(zhǔn)為P<0.05。 結(jié)果： 1.各組間血清IFN-γ水平的比較急性期MS組IFN-

7、γ水平(10.1076±1.3279)pg/ml與正常對照組(3.4321±0.5934)pg/ml比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；急性期MS組IFN-γ水平(10.1076±1.3279)pg/ml與緩解期MS組(3.4106±0.8473)pg/ml比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；緩解期MS組IFN-γ水平(3.4106±0.8473)pg/ml與正常對照組(3.4321±0.5934)pg/ml比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

8、P＞0.05)。 2.各組間腦脊液IFN-γ水平的比較急性期MS組IFN-γ水平(5.6862±1.0831)pg/ml與正常對照組(1.0545±0.1592)pg/ml比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0000)；急性期MS組IFN-γ水平(5.6862±1.0831)pg/ml與緩解期MS組(1.1404±0.2079)pg/ml比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；緩解期MS組IFN-γ水平(1.1404±0.2079)

9、pg/ml與正常對照組(1.0545±0.1592)pg/ml比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 3.急性期MS組腦脊液與血清IFN-γ水平增高程度的比較與正常對照組比較，急性期MS組腦脊液IFN-γ增高(4.6317±1.1190)pg/ml，急性期MS組血清IFN-γ增高(6.6755±1.4331)pg/ml，前者比后者增高明顯(P＜0.01)；與緩解期MS比較，急性期MS組腦脊液IFN-γ增高(4.5458±1.2

10、570)pg/ml，急性期MS組血清IFN-γ增高(6.6970±1.4420)pg/ml，前者比后者增高明顯(P＜0.01)。 4.各組間基因型分布和等位基因頻率的比較4.1 IFN-γ+2118位點(diǎn)MS組與健康對照組基因型分布的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；MS組IFN-γ+2118位點(diǎn)A等位基因頻率(81.03％)顯著高于健康對照組(66.25％)(P＜0.05)。 4.2 IFN-γ+2707位點(diǎn)MS組與

11、健康對照組基因型分布的比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；MS組IFN-γ+2707位點(diǎn)A及G等位基因頻率與健康對照組比較均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 4.3 IFN-γ+3586位點(diǎn)MS組與健康對照組基因型分布的比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；MS組FN-γ+3586位G及X點(diǎn)等位基因頻率與健康對照組比較均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。5.EDSS評(píng)分與病程、首次發(fā)病年齡、發(fā)病次數(shù)呈正相關(guān)(P<0.05)。