全蝎乙醇提取物對耐藥驚厥大鼠腦內(nèi)Pgp-mdr1基因和蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、目的：建立電刺激大腦皮層點(diǎn)燃的耐苯妥英鈉大鼠驚厥模型，研究全蝎乙醇提取物(Scorpion alcohol extraction，SAE)對該耐藥模型的對抗作用。觀察SAE對耐藥驚厥大鼠腦內(nèi)電刺激損傷區(qū)多藥耐藥基因mdrl mRNA及其產(chǎn)物P糖蛋白(P-glucoprotein，PgP)表達(dá)的影響，從基因和蛋白水平探討全蝎乙醇提取物抗耐藥的作用機(jī)制。同時了解苯妥英鈉和長期驚厥發(fā)作兩因素與耐藥大鼠腦內(nèi)多藥耐藥基因mdrl mRNA及Pgp

2、表達(dá)的關(guān)系。 方法：采用大鼠大腦皮層運(yùn)動區(qū)定位放置微電極并以強(qiáng)度15s內(nèi)從0增大至1000μA的單相斜坡梯形雙極脈沖反復(fù)電刺激此區(qū)域點(diǎn)燃的方法，建立大鼠驚厥模型。灌胃驚厥大鼠苯妥英鈉(PHT，0.154g·kg-1·d)7天，并于每次給藥后用上述相同參數(shù)電刺激皮層,建立耐苯妥英鈉大鼠驚厥模型。實(shí)驗(yàn)共設(shè)6組，分別為正常對照組、驚厥模型對照組、耐苯妥英鈉驚厥模型對照組、維拉帕米(0.0385g·kg-1)陽性對照組和大、小兩種劑量全

3、蝎乙醇提取物(6.5g·kg-1。13.0g·kg-1)組；給藥后觀察全蝎乙醇提取物對耐藥驚厥大鼠驚厥閾值和腦電變化的影響。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)，檢測腦內(nèi)mdrlmRNA的表達(dá)變化；計算各樣本mdrl基因擴(kuò)增條帶的灰度值(IOD)與內(nèi)參基因gapdh擴(kuò)增條帶的IOD值的比值，作為各組大鼠腦內(nèi)mdrl mRNA的表達(dá)量。采用免疫組化(SABC法)技術(shù)，檢測腦內(nèi)PgP的表達(dá)變化；光鏡下各腦組織切片隨機(jī)取6個視野并計數(shù)每

4、個視野中表達(dá)PgP的陽性細(xì)胞數(shù)，取6個視野平均數(shù)作為該切片PgP的表達(dá)量。統(tǒng)計分析全蝎乙醇提取物對耐藥驚厥大鼠腦內(nèi)mdrl mRNA和PgP表達(dá)量的影響，探索全蝎乙醇提取物的抗耐藥機(jī)制。 結(jié)果：(1)驚厥模型制備：42只大鼠，除正常對照鼠6只，術(shù)后死亡2只，實(shí)驗(yàn)過程中電極脫落4只被棄除外，其余30鼠電刺激大腦皮層后，均產(chǎn)生Ⅰ-Ⅴ級發(fā)作，EEG出現(xiàn)明顯的尖波、棘波或尖(棘)慢綜合波。電刺激大鼠大腦皮層第一天，驚厥閾值平均為1191

5、.00±181.981μA，隨后所有大鼠的驚厥閾值均持續(xù)下降，于第14天穩(wěn)定于513.50±26.16μA水平，驚厥模型建立成功。(2)耐苯妥英鈉驚厥模型制備：30只驚厥大鼠除6只作為驚厥模型對照外，其余24只驚厥大鼠灌胃苯妥英鈉。首次給藥后，所有接受苯妥英鈉處理的大鼠的驚厥閾值均較驚厥模型對照組顯著升高(P<0.01)。以后每天給藥并電刺激，所有大鼠的驚厥閾值均逐日下降，于藥后第7天基本穩(wěn)定于480.38±18.48μA水平，分別與給

6、PHT前驚厥閾值(515.34±23.5llμA)和驚厥模型對照組驚厥閾值(478.17±15.16μA)相比，均無統(tǒng)計學(xué)差異(P皆>0.05)，提示耐苯妥英鈉驚厥模型制備成功。(3)全蝎乙醇提取物的抗耐藥性驚厥作用：灌胃大、小兩種劑量全蝎乙醇提取物及維拉帕米，均可使大鼠驚厥閾值明顯升高，給藥前后組內(nèi)比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。對各組大鼠用藥后的驚厥閾值進(jìn)行組間比較結(jié)果表明，驚厥模型組與耐苯妥英鈉驚厥模型組驚厥閾值無統(tǒng)計學(xué)差異；

7、三個用藥組的驚厥閾值均高于驚厥模型組和耐苯妥英鈉驚厥模型組，有統(tǒng)計學(xué)差異(P分別<0.05)，同時癇性放電較藥前減輕。驚厥閾值從高至低依次為：全蝎乙醇提取物大劑量組>維拉帕米組>全蝎乙醇提取物小劑量組，但三組間相互比較均無統(tǒng)計學(xué)差異。(4)RT-PCR測定結(jié)果：電刺激大鼠大腦皮層后，模型對照組mdr1 mRNA表達(dá)量較正常對照組增加，但統(tǒng)計學(xué)無差異(P>0.05)；給予苯妥英鈉后，耐藥模型組mdr1 mRNA表達(dá)量較驚厥模型組繼續(xù)增高，

8、且統(tǒng)計學(xué)上具有顯著性差異(P<0.01)；分別灌胃全蝎乙醇提取物大、小劑量以及維拉帕米，均可減少mdr1 mRNA表達(dá)量，與耐藥模型組相比均有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(P分別<0.01)；維拉帕米組mdr1 mRNA表達(dá)量較全蝎乙醇提取物小劑量組少而較大劑量組多，但各組間相互比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。(5)免疫組化測定結(jié)果：模型對照組Pgp表達(dá)量雖然在數(shù)值上比正常對照組增高，但沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；耐苯妥英鈉驚厥模型組大鼠的

9、Pgp表達(dá)量較驚厥模型組明顯增高，有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)；全蝎乙醇提取物大、小劑量組以及維拉帕米陽性對照組Pgp水平均較耐苯妥英鈉模型組降低，統(tǒng)計學(xué)上均有顯著性差異(P分別<0.01)；但維拉帕米組Pgp表達(dá)量分別與全蝎乙醇提取物大、小劑量組比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。各組Pgp表達(dá)變化趨勢與RT-PCR測定的mdr1 mRNA表達(dá)變化結(jié)果一致。 結(jié)論：(1)電刺激大鼠大腦皮層運(yùn)動區(qū)14天，大鼠出現(xiàn)恒定的部分

10、發(fā)作-繼發(fā)全身性發(fā)作(iv～v級)和典型的癇性放電。灌胃苯妥英鈉7天，驚厥大鼠對苯妥英鈉產(chǎn)生耐受，耐苯妥英鈉驚厥模型造模成功。該模型作為新型耐藥驚厥動物模型用于探討難治性癲癇的作用機(jī)制和抗耐藥制劑的篩選研究具有推廣使用價值。(2)苯妥英鈉可顯著誘導(dǎo)mdr1基因mRNA和Pgp的表達(dá)，而長期驚厥發(fā)作對其表達(dá)也有一定的誘導(dǎo)作用。可見電刺激大鼠大腦皮層點(diǎn)燃耐苯妥英鈉驚厥模型產(chǎn)生耐藥的機(jī)制與苯妥英鈉和長期驚厥發(fā)作兩方面因素協(xié)同誘導(dǎo)mdr1 mR

11、NA和Pgp表達(dá)增加有關(guān)。(3)兩種劑量全蝎乙醇提取物和維拉帕米灌胃給藥，均能使耐苯妥英鈉驚厥大鼠的驚厥閾值升高，癇性放電減輕，對該耐藥驚厥模型產(chǎn)生對抗作用，且抗耐藥驚厥作用性質(zhì)與維拉帕米相似。提示，全蝎乙醇提取物用于防治難治性癲癇可能有效。(4)兩種劑量全蝎乙醇提取物和維拉帕米均可抑制耐藥驚厥大鼠腦內(nèi)mdr1 mRNA表達(dá)，同時可明顯降低耐藥驚厥大鼠腦內(nèi)耐藥蛋白Pgp的含量。說明全蝎乙醇提取物和維拉帕米的抗耐藥機(jī)制與其抑制耐藥驚厥大鼠

12、腦內(nèi)mdr1 tuRNA表達(dá)和相應(yīng)減少其表達(dá)產(chǎn)物Pgp有關(guān)。由于全蝎乙醇提取物和維拉帕米組大鼠腦內(nèi)Pgp表達(dá)變化趨勢與RT-PCR測定的mdr1 mRNA表達(dá)變化結(jié)果一致，可見全蝎乙醇提取物抑制Pgp表達(dá)的直接原因與抑制了Pgp基因mdr1 mRNA的表達(dá)有關(guān)，從而發(fā)揮了抗耐藥作用，而且其作用性質(zhì)與維拉帕米相似。(5)維拉帕米是國際公認(rèn)的第一代Pgp抑制劑，臨床作為添加劑用劑量遞增法治療難治性癲癇部分性發(fā)作，療效確切，安全可靠。全蝎乙醇