外源激素控制奶牛和奶山羊超數(shù)卵泡同步發(fā)育及其卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的研究.pdf

1、優(yōu)質(zhì)的可供核移植的受體細(xì)胞(卵母細(xì)胞)來(lái)源有限已成為克隆技術(shù)應(yīng)用于理論研究和實(shí)際生產(chǎn)的瓶頸問(wèn)題之一。優(yōu)良的種畜、珍稀的野生動(dòng)物(如熊貓等)的卵母細(xì)胞來(lái)源則尤為緊張和稀有，從而極大地限制了對(duì)優(yōu)良種畜及珍稀野生動(dòng)物的克隆和育種以及相關(guān)核移植基礎(chǔ)研究工作的開(kāi)展。目前，卵母細(xì)胞的主要來(lái)源有：自屠宰場(chǎng)廢棄卵巢中獲得、外源激素誘導(dǎo)成年動(dòng)物卵巢卵泡超數(shù)發(fā)育后活體穿刺或誘導(dǎo)排卵。前者途徑獲得的卵母細(xì)胞數(shù)量少且發(fā)育潛能不足(因屠宰和長(zhǎng)途運(yùn)輸造

2、成)。而用外源激素誘導(dǎo)成年動(dòng)物卵巢卵泡超數(shù)發(fā)育獲取卵母細(xì)胞，往往受動(dòng)物的年齡、情期、卵巢卵泡狀態(tài)等諸多因素的影響，使不同供體之間對(duì)外源激素的應(yīng)答反應(yīng)多變，因而影響獲得的卵母細(xì)胞的數(shù)量及其質(zhì)量。且因?yàn)檫^(guò)去對(duì)家畜卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞發(fā)育動(dòng)力學(xué)知識(shí)了解的貧乏，因此在對(duì)供體實(shí)施外源激素刺激時(shí)未考慮卵泡和卵母細(xì)胞在體內(nèi)的發(fā)育特點(diǎn)，致使獲得的卵母細(xì)胞發(fā)育潛能不足。鑒于以上情況，本研究結(jié)合目前對(duì)卵泡發(fā)育動(dòng)力學(xué)的了解進(jìn)行了兩個(gè)方面的探索：第

3、一，利用光明乳業(yè)集團(tuán)淘汰的高產(chǎn)奶牛作為卵母細(xì)胞供體，對(duì)這些供體實(shí)施不同的外源激素組合的處理方案，以期獲得超數(shù)同步發(fā)育并數(shù)量眾多的卵泡。外源激素的具體組合為：E2-P4-FSH聯(lián)合處理后12小時(shí)取卵巢、E2-P4-FSH聯(lián)合后48小時(shí)取卵巢、E2-P4-FSH-LH聯(lián)合處理后6小時(shí)取卵巢、E2-P4-FSH-LH聯(lián)合處理后26小時(shí)取卵巢(分別簡(jiǎn)稱FSH12hr，F(xiàn)SH48hr，LH6hr，LH26hr)。然后從這些卵泡中回收CO

4、Cs進(jìn)行體外成熟，并將成熟的卵母細(xì)胞用于優(yōu)質(zhì)種公牛的體細(xì)胞克隆以驗(yàn)證該卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示E2-P4組合處理能成功地誘導(dǎo)一個(gè)新的卵泡起始波，P4-陰道栓(模擬黃體)的持續(xù)存在能保證卵泡同步發(fā)育；與未經(jīng)處理的對(duì)照組(屠宰場(chǎng)組)相比，四組外源激素處理的供體來(lái)源的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂能力沒(méi)有差異，但均顯著高于對(duì)照組； 五組的成熟卵均能用于核移植，核移植成功率之間無(wú)顯著差異，但去核的卵胞質(zhì)體與供核體細(xì)胞之間的融合率差異顯著

5、，其中對(duì)照組的融合率最低(p＜0.01)，而經(jīng)外源激素處理的其它四組的融合率，則以來(lái)自FSH12hr處理組的最高(p＜0.01)，余下三組之間的差異不顯著；融合后的胚胎成為重構(gòu)胚。重構(gòu)胚胎移入奶山羊輸卵管內(nèi)培養(yǎng)7天后，以回收到的胚胎為基數(shù)，五組之間的卵裂率無(wú)顯著性差異，但就囊胚發(fā)育率，屠宰場(chǎng)組的最低(p＜0.01)，F(xiàn)SH12hr組次之(p＜0.01)，其它三組之間的囊胚發(fā)育率差異不顯著；當(dāng)將這些囊胚移植同步發(fā)情的受體牛后，

6、來(lái)自屠宰場(chǎng)的囊胚無(wú)-著床(未見(jiàn)孕囊)，而在四組外源激素處理組之間，LH6hr和LH26hr組顯著高于其它兩組，但最終僅LH26hr組來(lái)源的克隆胚胎實(shí)現(xiàn)全程發(fā)育至誕生克隆后代。上述五個(gè)實(shí)驗(yàn)組的卵泡的生理生化特征分析表明：未經(jīng)激素處理的對(duì)照組中卵泡顆粒細(xì)胞中Bax以及卵泡液內(nèi)IGFBP蛋白的過(guò)量表達(dá)使卵泡進(jìn)入凋亡的中后期，使屠宰場(chǎng)組卵母細(xì)胞發(fā)育能力不足，而FSH12hr組卵泡仍處于活躍生長(zhǎng)期，故幾乎未檢測(cè)到Bax以及IGFBP蛋

7、白的表達(dá)，但FSHr mRNA含量處于高水平，使屠FSH12hr組來(lái)源的卵母細(xì)胞的發(fā)育能力亦不足；當(dāng)卵巢卵泡經(jīng)歷48hr(即FSH48hr、LH6hr組和LH26hr組)的饑餓處理，卵泡的壁層顆粒細(xì)胞開(kāi)始表達(dá)Bax蛋白，卵泡液中呈現(xiàn)IGFBP，卵泡處于早期閉鎖狀態(tài)，由FSH依賴期轉(zhuǎn)為L(zhǎng)H依賴期，表現(xiàn)為高水平轉(zhuǎn)錄LHr mRNA，致使卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能增加，表現(xiàn)為核移植囊胚發(fā)育率上升；添加和延長(zhǎng)LH的處理時(shí)間可使卵胞質(zhì)獲得完全成

8、熟，表現(xiàn)為核移植后重構(gòu)胚的著床率、著床后發(fā)育率以及出生率的提高。為充分利用卵巢種質(zhì)資源，本研究又以青春期之前的奶山羊?yàn)檠芯繉?duì)象，探索青春期之前家畜卵巢卵泡發(fā)育的特點(diǎn)以及其卵母細(xì)胞的發(fā)育能力。為此，本研究比較了幾種激素不同組合的處理方法(對(duì)照、FSH、E2-P4和E2-P4-FSH)對(duì)出生39-60 日齡(又稱早青春期前)奶山羊卵巢的大小、卵泡數(shù)量及其大小的影響；同時(shí)將出生39-120日齡奶山羊按不同年齡段分成三組，研究不同年

9、齡段經(jīng)激素處理后對(duì)卵泡招募起始生長(zhǎng)數(shù)量的影響；然后，比較了來(lái)自E2-P4-FSH和FSH處理的早青春期前奶山羊卵巢中直徑大于3mm卵泡的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂能力；最后，通過(guò)SCNT方法驗(yàn)證E2-P4-FSH處理的早青春期前奶山羊卵巢直徑大于3mm卵泡的卵母細(xì)胞的發(fā)育能力。在四組激素處理的早青春期前奶山 羊中，E2-P4-FSH處理組產(chǎn)生了最大的卵巢、最高的卵泡數(shù)量(直徑大于3mm)。在不同年齡段的E2-P4-FSH處理組中，3

10、9-60天組奶山羊卵巢上直徑大于3mm的卵泡數(shù)量顯著高于61-90天和91-120天組的。卵母細(xì)胞減數(shù)分裂能力的分析結(jié)果表明，來(lái)自E2-P4-FSH處理組的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂能力顯著高于FSH處理組的卵母細(xì)胞。與E2-P4-FSH處理后的成年奶山羊卵母細(xì)胞相比，早青春期前奶山 羊卵母細(xì)胞發(fā)育能力較低：成熟后用于體細(xì)胞核移植后的囊胚發(fā)育率低于成年奶山羊(15.3％versus 22.1％，p＜0.01)。然而，早青春期前的奶山羊經(jīng)

11、E2-P4-FSH處理后，每頭羊卵巢上直徑大于3mm的卵泡數(shù)顯著高于成年奶山羊(108±10.3 Versus 28±5.0)，因此，每頭早青春期前奶山羊產(chǎn)生的囊胚絕對(duì)數(shù)量顯著高于成年奶山羊(7.1±2.7versus 4.2±1.4)。由以上結(jié)果;本研究可以得出如下結(jié)論：E2-P4-FSH48hr-LH26hr是一個(gè)最佳的促卵泡超數(shù)發(fā)育和卵母細(xì)胞獲得發(fā)育潛能的不同外源激素組合處理組，此組合處理的供體牛卵巢能獲得具備完全發(fā)育