恩度對腫瘤上清液誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖、凋亡的影響及其機制的初步研究.pdf

1、目的：
　　 生理狀態(tài)下,血管生成促進因子和抑制因子處于動態(tài)平衡,共同參與調(diào)節(jié)體內(nèi)的血管生成,而在腫瘤形成等病理狀態(tài)下,這種平衡被破壞,血管生成促進因子占優(yōu)勢,腫瘤血管得以生成,腫瘤得以生長。近年來,利用血管生成抑制因子來抑制腫瘤血管生成,從而達到治療腫瘤目的已成為研究的熱點。內(nèi)皮抑素是一種內(nèi)源性血管內(nèi)皮細胞抑制因子,能有效抑制血管生成,其在血管依賴性腫瘤的治療中將發(fā)揮不可替代的作用,但其在體內(nèi)含量甚微,且提取困難。因此,中國學

2、者研制了一種重組人內(nèi)皮抑素制劑——恩度(Endostar),目前恩度已經(jīng)得到SFDA認可,臨床用于治療非小細胞肺癌,但它的作用機制尚不明確[1,2]。
　　 磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt信號轉(zhuǎn)導通路參與調(diào)節(jié)細胞的生存和凋亡,活化的Akt可磷酸化Bad、caspase9,活化NF-κB,從而發(fā)揮抗凋亡的作用。
　　 細胞外信號調(diào)節(jié)激酶ERK是分裂原活化蛋白激酶MAPK信號傳導通路的家族成員之一,調(diào)節(jié)細胞外信號向細胞

3、內(nèi)的傳遞,與細胞的分化、增殖和凋亡關系密切,已有多項研究表明其與腫瘤的發(fā)生、惡變及血管生成有關[3]。
　　 Cbl-b和c-Cbl是泛素連接酶Ring-finger家族的兩個成員,二者具有高度同源性,因參與胸腺細胞生成和T細胞的活化等免疫過程而被人們所認識,但近年來越來越多的研究表明,它們在胃癌等惡性腫瘤中被高表達,參與調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長、凋亡和腫瘤血管生成等。新近研究表明,Cbl-b作為PI3K的上游分子,促進了PI3K的調(diào)

4、節(jié)亞單位p85的泛素化,進而影響PI3K下游的細胞凋亡和周期相關蛋白的表達,參與細胞增殖和凋亡等過程[4,5]。
　　 為了進一步明確恩度的抗腫瘤血管生成能力和作用機制,本實驗對恩度對腫瘤上清液誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)增殖和凋亡的影響及p-Akt、p-ERK、c-Cbl及Cbl-b在恩度作用過程中的作用進行了探討。
　　 材料與方法：
　　 一、細胞培養(yǎng)
　　 HUVECs購自中國科學院上海

5、細胞庫,用含20％滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),37℃、5％CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱孵育,每日換液一次,2-3日傳代一次,用0.125％的胰蛋白酶消化細胞。
　　 二、腫瘤上清液的制備
　　 培養(yǎng)腎癌ACHN細胞,當其融合達80％時換以無血清DMEM培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24小時,離心收集上清液,將其與DMEM培養(yǎng)液以1:4的比例混勻備用。
　　 三、實驗分組
　　 對照組(恩度濃度為Oμg/ml)、實驗組(

6、恩度濃度為25μ/ml,50μg/ml,100μg/ml,200μg/ml)。
　　 四、四甲基偶氮唑藍還原反應(MTT)法檢測細胞活力
　　 五、Annexin V-FITC/PI雙染法流式細胞儀檢測細胞凋亡
　　 六、Western blot檢測Cbl-b,c-Cbl,p-Akt和p-ERK蛋白的表達
　　 七、統(tǒng)計學處理:
　　 每項實驗重復3次,采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)

7、據(jù)用平均數(shù)士標準差表示,多組均數(shù)比較用方差分析,相關性比較采用Pcarson分析方法。
　　 實驗結果：
　　 恩度以濃度依賴性方式抑制腫瘤上清液誘導的HUVECs增殖,恩度濃度為25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml時,HUVECs的抑制率分別為11.83％、25.75％、40.37％及51.74％,實驗組與對照組比較,差異具有統(tǒng)計學意義,恩度濃度與HUVECs的抑制率呈正相關(P＜0.05

8、,R=0.963)。
　　 恩度作用于腫瘤上清液誘導的HUVECs24小時后,呈濃度依賴性促進了HUVECs的凋亡。恩度濃度為25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml時,HUVECs的凋亡率分別為5.45％、6.83％、7.19％、10.75％及12.8％,實驗組與對照組比較,差異具有統(tǒng)計學意義,恩度濃度與HUVECs的凋亡率呈正相關(P＜0.01,R=0.972)。
　　 恩度于腫瘤上清液誘導

9、HUVECs24小時后,Cbl-b、p-Akt、c-Cbl及p-ERK蛋白的表達均被下調(diào)。當恩度濃度為0(對照組)、25、50、100、200μg/ml時,Cbl-b的表達率分別為89.2％、80.9％、52.9％、19.8％及16.7％;p-Akt的表達率分別為46.7％、37.7％、35.6％、28.1％及26.2％;c-Cbl的表達率分別為89.4％、70.9％、58％、34.8％及16.8％;p-ERK的表達率分別為82.7％、

10、74.6％、64.1％、26.5％及19.3％。以上四種蛋白的表達隨恩度濃度升高逐漸降低,實驗組與對照組相比,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。同時,HUVECs增殖抑制率及凋亡率的變化趨勢與Cbl-b、p-Akt、c-Cbl及p-ERK蛋白表達的變化趨勢相一致。此結果提示,泛素連接酶Cbl-b和c-Cbl,以及p-Akt、p-ERK參與恩度抑制HUVECs增殖和促進其凋亡的作用過程。
　　 結論：
　　 恩度抑制腫瘤