KK-42對日本沼蝦幼蝦蛻皮周期的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）隸屬甲殼綱(Crustacea)、長臂蝦科(Palaemonidae)、沼蝦屬(Macrobrachium)，廣泛分布于各地的淡水中，由于其自身的環(huán)境適應(yīng)優(yōu)勢和經(jīng)濟(jì)價值，使其成為了我國具有較大發(fā)展?jié)摿Φ牡B(yǎng)殖品種。我們前期研究證實(shí)，咪唑類物質(zhì)KK-42處理能顯著促進(jìn)凡納濱對蝦(Penaeus schmitti)、日本沼蝦幼蝦的生長，但作用機(jī)制并不十分清楚。甲殼動物的生長與蛻皮

2、密切相關(guān)，為了探索KK-42的作用機(jī)理，本文以日本沼蝦幼蝦為材料，采用生測方法，在進(jìn)一步明確KK-42促生長效應(yīng)的基礎(chǔ)上，首先測定了幼蝦蛻皮周期的時程，深入分析了3個與蛻皮有關(guān)的基因表達(dá)變化和蛻皮周期的關(guān)系，觀察了表皮超微結(jié)構(gòu)的變化，具體方法和結(jié)果如下:
　　以水產(chǎn)基地自行繁殖的2月齡幼蝦(體長1.2～2.0 cm)為材料，捕撈后暫養(yǎng)于流水養(yǎng)殖水槽，水溫（26±1)℃，每天投喂2次，1周后用于實(shí)驗(yàn)研究。用1.95×10-4 mol

3、/L的KK-42溶液（處理組）或不含KK-42溶液（對照組）浸潤1 min，取出，一部分用于幼蝦生長速率、蛻皮周期的測定;從剩余部分中選擇處于不同蛻皮階段的幼蝦，分別在不同時間段取處理組和對照組的不同組織，用于RNA的提取、基因的克隆、幾丁質(zhì)酶(Chitinase)和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase，NAGase) mRNA的相對表達(dá)水平、相應(yīng)的酶活性測定和表皮超微結(jié)構(gòu)觀察。

4、r>　　在實(shí)驗(yàn)觀察期間，KK-42處理組平均體質(zhì)量均顯著高于對照組，體質(zhì)量增長率的升高出現(xiàn)在處理后的前2周。隨著幼蝦的生長，蛻皮周期的持續(xù)時間均趨于延長，在4個連續(xù)測定的蛻皮周期中，KK-42處理能明顯縮短前2個周期的時程，分別從（8.70±1.07）、（9.81±0.43）d/周期縮短為（6.93±0.97）、（8.11±1.20）d/周期。
　　首次從日本沼蝦表皮組織中克隆出2個幾丁質(zhì)酶基因（M.nipponenseChiti

5、nase gene，MnChi）cDNA全長序列:MnChi-1和MnChi-3，其cDNA全長分別為1532 bp和1413 bp，各含有一個66 bp和26 bp的5'非翻譯區(qū)，236bp和247 bp的3'非翻譯區(qū)，以及一個1230bp和1140 bp的開放閱讀框。其基因編碼的蛋白質(zhì)分別由410和380個氨基酸組成，預(yù)測其分子量為46.32 kDa和42.52kDa，理論等電點(diǎn)(pI)為4.75和4.76。結(jié)構(gòu)域分析表明，它們均含

6、有一個信號肽、一個典型肽段催化域和糖基水解酶18家族保守域;氨基酸多重比對分析顯示它們都缺泛S/T富集連接區(qū)和CBDs結(jié)構(gòu)域。
　　MnChi-1在表皮、腸道、尤其在肝胰腺組織高表達(dá)，其中，在表皮和肚胰腺中，蛻皮前期(D)表達(dá)量最高;Mnchi-3在表皮、肝胰腺、眼柄和腸道中均有表達(dá)，腸道組織最高，其周期表達(dá)模式與Mnchi-1類似。
　　KK-42處理可顯著上調(diào)蛻皮間期（C）表皮MnChi-1的表達(dá)，在第3、6和9h，其m

7、RNA水平高于對照組10倍以上，酶活力同比提高2倍以上; KK-42處理對D期的影響相對較弱，該基因的表達(dá)水平及酶活性僅在12h顯著升高。KK-42對肝胰腺M(fèi)nChi-1的影響類似。
　　KK-42對表皮和肝胰腺M(fèi)nChi-3轉(zhuǎn)錄及酶活性水平的影響與MnChi-1相似，顯著的誘導(dǎo)作用主要發(fā)生在C期。
　　首次從日本沼蝦表皮中克隆出MnNAGase(M.nipponense NAGase，MnNAGase)cDNA全長序列，全

8、長2536 bp，ORF長度為1854 bp，5'UTR為382bp，3'UTR為300 bp，預(yù)測蛋白的理論分子量為69.72 kDa，等電點(diǎn)為(PI)5.43。編碼白617個氨基酸，結(jié)構(gòu)域分析顯示，它具有一個信號肽，一個糖苷水解酶20家族保守域，9個催化結(jié)構(gòu)域特征保守位點(diǎn)，該段保守域氨基酸序列與凡納濱對蝦和中國明對蝦（Fenneropenaeus chinensis）的相似度90.4％。該基因在表皮中的周期表達(dá)D期最高。
　　

9、KK-42處理可以顯著上調(diào)C期表皮MnNAGase mRNA的表達(dá)，處理后3h快速升高，6h達(dá)到峰值，同比增加4倍以上（P＜0.01）;酶活性呈類似的變化趨勢。KK-42對D期表皮MnNA Gase的上調(diào)效應(yīng)較弱，僅在處理后6h，轉(zhuǎn)錄量明顯升高，而酶活性在3、6和9h均顯著高于對照組。
　　表皮上皮細(xì)胞層是蛻皮激素作用的靶組織，鑒于KK-42對C期Chitinase、NAGase活性及其基因表達(dá)顯著的調(diào)節(jié)效應(yīng)，采用透射電鏡觀察了分

10、泌此酶的上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)在C期的變化。結(jié)果顯示，C期為單層假復(fù)層上皮細(xì)胞，扁平、排列規(guī)則;KK-42處理后9h，上皮細(xì)胞延伸變長，多種細(xì)胞器如高爾基體、線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等大量出現(xiàn)。
　　結(jié)論:KK-42處理能顯著促進(jìn)口本沼蝦幼蝦的生長和縮短其蛻皮周期;明顯上調(diào)表皮和肝胰腺M(fèi)nChi-1、MnChi-3和表皮MnNAGase的表達(dá)及酶活力;可以激發(fā)上皮細(xì)胞層的細(xì)胞活性，可能加速了多種酶的合成分泌和運(yùn)輸，進(jìn)而加快了舊表皮的降